Микробиология сырья и продуктов животного происхождения

1. Общие вопросы микробиологического контроля мясного сырья.

2. Основные методы оценки микробных показателей мясного сырья.

3. Микробиологическое исследование молока.

4. Санитарная оценка молока при болезнях животных.

1. Мышцы здоровых животных и птиц не содержат микроорганизмы. Загрязнение мяса микробами начинается в момент убоя. Кровь, вытекающая из артерий, отчасти засасывается вновь через вены, зияющие в ране и имеющие отрицательное давление. Обсеменение поверхности мяса происходит при снятии шкуры и разделке туши. Особенно сильно загрязняется мясо, если при обработке туши повреждают кишечник. Дальнейшее загрязнение поверхности мяса происходит при его транспортировке и хранении. Микроорганизмы, попавшие в мясо, при благоприятной температуре могут размножаться, поскольку этот продукт является хорошей питательной средой количество их на 1 см² поверхности мяса может достигать многих миллионов.

Гарантией доброкачественности и эпидемической безопасности мяса и мясных продуктов на этапе их продвижения от предприятия к потребителю является ветеринарный и санитарно-микробиологический контроль. Бактериологическое исследование мяса проводят во всех случаях предусмотренных НТД (научно-технической документацией), правилами ВСЭ и другими нормативными актами.

Бактериологическое исследование мяса и мясопродуктов проводят во всех случаях, предусмотренных правилами ветеринарно-санитарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясных продуктов, а именно:

- во всех случаях вынужденного убоя животных, независимо от причин убоя;

- при желудочно-кишечных болезнях, при тяжело протекающих заболеваниях органов дыхания;

- микробиологическое исследование мяса проводят во всех случаях, когда предполагают обсеменение возбудителями зооантропонозов или пищевых токсикоинфекций и токсикозов;

- при удалении кишечника из туши позже двух часов после убоя животного;

На бактериологическое исследование должно быть направлено мясо, если не возможно определить пригодность его в пищу по результатам органолептического исследования, а также по ряду физико-химических показателей. При наличии обильного микробного обсеменения мяса установленного в результате микроскопии мазков-отпечатов, т.е. при сомнении в отношении пригодности мяса и невозможности определить пригодность его в пищу путем ветеринарно-санитарного осмотра.

Чаще на поверхности мясных туш находятся стафилококки и микрококки, молочнокислые бактерии, бактерии группы кишечных палочек, различные виды гнилостных аэробных бацилл и анаэробных клостридий, дрожжи и споры плесневых грибов.

Отбор проб.В зависимости от предполагаемого диагноза и характера патолого-анатомических изменений в микробиологический отдел от каждой туши направляют пробы мышц, лимфатических узлов и внутренних органов:

Каждую пробу завертывают отдельно, помещают в общую упаковку, на которой ставят дату отбора образцов, номер туши. Тару с образцами опечатывают или опломбируют.

В сопроводительном документе указывают: вид и количество мяса, номера образцов, адрес хозяйства, причину исследования, дату и подпись направившего. Пробы охлажденных продуктов транспортируют при температуре от 0 до 2⁰С. Пробы мяса, предназначенные для микробиологического анализа, исследуют непосредственно после поступления их в лабораторию.

Микробиологический контроль мяса и мясопродуктов проводят для определения количества МАФАнМ, бактерий группы кишечных палочек, возбудителей зооантропонозов, обнаружение сальмонелл, палочки протея, токсичных стафилококков и патогенных анаэробов - в случае сомнений в отношении пригодности мяса и невозможности определить пригодность его в пищу путем ветеринарно-санитарного осмотра.

Исследование мяса состоит из следующих этапов:

1. Органолептическая оценка мяса.

2.Микроскопическое исследование препаратов, приготовленных из мяса, окрашенных по Граму, на капсулу и споры.

3.Первичный посев на МПА, МПБ, селективные и специальные среды, среды обогащения.

4.Идентификация выделенных культур по морфологическим, культурально-биохимическим и антигенным свойствам.

5.Заражение лабораторных животных в необходимых случаях.

Продолжительность бактериологического исследования мяса 3 суток, при постановке биопробы до 10 суток. Исследуемые туши после взятия проб помещают в холодильник-изолятор при температуре 0-4⁰С.

Органолептическая оценка мяса. Доброкачественное мясо при подсыхании образует корочку бледно-красного цвета. На разрезе оно плотное, эластичное, ямка после надавливания быстро исчезает. Несвежее мясо покрыто плотной, темно-красной или ослизненной корочкой. Консистенция его мягкая, несколько дряблая, образующаяся при надавливании ямка восстанавливается. Поверхность испорченного мяса ослизненная, консистенция дряблая, мажущаяся; жир слизистый с прогорклым запахом – такое мясо бракуют.

Для микроскопического исследования мяса из каждой пробы готовят препараты-отпечатки для окрашивания по Граму, на наличие капсул - по Ольту или Михину. В каждом препарате изучают не менее 25 полей зрения.

Для приготовления препарата-отпечатка стерильными ножницами вырезают из середины каждого образца кусочек размером 1,5х2х2,5 см и прикладывают к предметному стеклу местом свежего среза. Делают по 3 отпечатка на 2-3 предметных стеклах. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки. Мазки можно фиксировать физическим или химическим методом. При химическом методе фиксации препараты погружают в метанол на 5 мин или на 15 мин в смесь Никифорова (равные объемы спирта и эфира), окрашивают по Граму и подсчитывают количество микроорганизмов в каждом поле зрения, учитывая отдельно шаровидные и палочковидные (табл.1)

Таблица 1

Оценка свежести мяса микроскопическим методом

Степень свежести мяса	рН мяса	Микроскопические показатели
Свежее	5,9-6,5	Единичные кокки или палочки; На стекле нет остатков ткани
Подозрительной свежести	6,6	До 20-30 кокков, единичные палочки. На стекле следы распада мышечной ткани
Несвежее	6,7	Множество палочек, на стекле распавшаяся мышечная ткань

Мясо считается свежим, если в мазках-отпечатках не обнаружена микрофлора или в поле зрения препарата видны единичные (до 10 клеток) кокки и палочковидные бактерии и нет следов распада мышечной ткани. Препарат-отпечаток из мяса сомнительной свежести окрашивается удовлетворительно, видны следы распада мышечной ткани, ядра мышечных волокон в состоянии распада. При просмотре в каждом поле зрения обнаруживается не более 30 кокков или палочек.

Препарат-отпечаток из мяса непригодного в пищу, окрашивается хорошо. В поле зрения в препаратах, как из поверхностных, так и из глубинных слоев преобладают палочки. При сильном разложении мяса кокки почти отсутствуют, все поле зрения состоит из палочек. Среди них могут быть кишечные палочки, флуоресцирующие бактерии, спорообразующие бактерии. (Из аэробных спорообразующих бактерий – Bac.subtilis, Bac.mycoides; из факультативно-анаэробных – Proteus vulgaris, из анаэробных - Cl.putrificus, Cl.sporogenes).

2. Мясо получают путем убоя животного, обескровливания и разделения туши. Первичное обсеменение микроорганизмами может происходить при жизни животного и при обескровливании, вторичное обсеменение — при снятии шкуры, разделке и нутровке туши. Для оценки качества мяса необходимо исследовать наличие и степень обсемененности санитарно-показательными микроорганизмами.

Определение общей обсемененности бактериями поверхности мяса. Для этого накладывают трафарет с внутренним отверстием 1—4 см² и обтирают поверхность внутри трафарета ватным тампоном (стерильным). Тампоны вносят в колбу со 100 мл стерильной водопроводной водой, тщательно взбалтывают в ней, готовят разведения, которые высевают затем на МПА, и ставят в термостат. Выросшие колонии подсчитывают на 4-е сутки. Умножив число колоний на степень разведения и разделив на площадь трафарета, получают число бактерий на 1 см² поверхности мяса.

Прямой учет микроорганизмов в мясе и определение степени проникновения их в мясо. Используют метод пластинок (препарат-отпечаток). Для этого стерильным скальпелем делают перпендикулярный разрез, прикладывают обезжиренное стерильное предметное стекло, сушат его, фиксируют и окрашивают по Граму. В поле зрения микроскопа подсчитывают палочки и кокки, определяют соотношение между ними, а также между грамотрицательными и грамположитель- ными микроорганизмами. Наличие в препарате большого количества грамотрицательных палочек указывает на обилие гнилостных бактерий. Разделив препарат на определенные отрезки, можно определить степень проникновения микроорганизмов в мясо. Для этого под предметное стекло подкладывают полоску миллиметровой бумаги и отмечают сантиметры и миллиметры карандашом по стеклу. Если в мазке видна только технологическая микрофлора, то продукт считается доброкачественным

Обнаружение гнилостной микрофлоры, или микрофлоры, обладающей протеазой. Для этого берут по 1 мл из разных разведений кашицы мяса (измельченная навеска мяса массой 2—5 г) и засевают чашки Петри с МПЖ. Через 7 сут подсчитывают палочки, разжижающие желатину. Умножив число колоний на степень разбавления и разделив на массу навески или же число миллилитров жидкости, получают число протеолитических бактерий на 1 г мяса или другого пищевого продукта.

Определение количества спор плесневых грибов на мясе или пищевом продукте. Соскабливают слизь с поверхности определенной площади и из нее готовят взвесь в определенном объеме стерильной водопроводной воды. Каплю полученной взвеси помещают в камеру Томаса—Цейса, Петрова—Хауссера, Горяева и др., накрывают покровным стеклом и подсчитывают число спор, клеток бактерий в квадратах этих камер (см. Прямые и косвенные методы подсчета клеток микроорганизмов).

Для детального анализа одной-двух наиболее характерных групп микроорганизмов применяют обычные селективные питательные среды.

Оценка потенциальной опасности по санитарным показателям. Индикаторами фекального обсеменения служат бактерии группы кишечной палочки (БГКП), относящиеся к родам Escherichia, Enterobacter и Klebsiella. В соответствии с номенклатурой, принятой ФАО/ВОЗ, а также требованиями ГОСТ 2874-82, при кратном санитарном анализе к ним относят грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 36 °С в течение 24 ч, не обладающие оксидазной активностью и образующие на агаре Эндо типичные колонии.

К группе колиформных бактерий по международной номенклатуре относят и род Serracia, причем всю группу принято определять по ферментации лактозы, что позволяет считать ее идентичной БГКП. Наибольшее значение имеет Eschericha.

Исследования на БГКП проводятся при первичной санитарно- гигиенической оценке оборудования, находящегося в опытной эксплуатации, при планово-предупредительном надзоре на предприятиях пищевой мясо-молочной промышленности и при обследовании по эпидемиологическим показаниям.

Количественная оценка по санитарным показателям. Определяют наиболее вероятное число БГКП на среде Кесслера или КОДА, соблюдая отношение субстрата и среды 1 : 10. Из твердых продуктов предварительно готовят исходную суспензию, приводя массу продукта к 0,1, 1, 10 г и т.д. Посевы термостатируют в течение 24 ч при температуре 37 °С и по характеру газообразования и изменения цвета среды КОДА делают заключение сразу, а при наличии роста на среде Кесслера выполняют контрольные высевы на чашки Петри со средой Эндо. После инкубации при температуре 37 °С через 24 ч анализируют колонии и другие показатели роста.

В зависимости от числа «проросших» пробирок по табл. 2 определяют наиболее вероятное число колиформных бактерий (наиболее вероятные значения микробного индекса).

Примечание. Постановка оксидазного теста: две-три колонии, выросшие на среде Эндо, петлей переносят на фильтровальную бумагу, смоченную реактивом (d-нафтол и диэтил-я-фенилендиамин), результат читают через 2—4 мин. Места бумаги, куда были перенесены колонии оксидазоположительных бактерий, становятся синими. Отсутствие изменения в окраске бумаги (отрицательный результат оксидазной пробы) и наличие грамотрицательных палочек в мазке свидетельствуют о росте кишечной палочки.

Учет анаэробных бактерий. В пробирку с МПА (заполненную на ²/з объема расплавленной и охлажденной до 40 °С средой), стерильным пинцетом вносят кусочек мяса или мясного продукта. Вращая пробирку между ладонями, заставляют образец погрузиться на дно. Термостатируют пробирку при температуре 30—35 °С в течение 3—5 сут. При наличии в образце анаэробных бактерий столбик агара в пробирке будет разорван образующимися газами.

Таблица 2

Определение наиболее вероятного числа колиформных бактерий

Особенности микроорганизмов и их колоний при росте на среде Эндо	Результат
Колонии отсутствуют или имеют вид пленок с неровными поверхностью и краями, не характерных для кишечных палочек	Кишечные палочки в пробе отсутствуют
Колонии темно-красные с металлическим блеском или без него, розовые, прозрачные: • в мазках нет грамотрицательных неспороносных палочек • оксидазный тест положительный, колонии темно-красные	Кишечные палочки в пробе отсутствуют Колонии принадлежат кишечной палочке
Колонии розовые, бесцветные: • на полужидкой среде с глюкозой образуются кислота и газ • на этой же среде кислота и газ не образуются	Колонии принадлежат кишечной палочке Кишечные палочки в пробе отсутствуют

Микробиологическое исследование мяса и мясных продуктов позволяет оценить их состояние в конкретный отрезок времени и пригодность для употребления в пищу человека, замораживания и переработки. Важно знать, какую часть исходного содержания микроорганизмов составляют морозоустойчивые, холодотолерантные и психрофильные бактерии, а также фекальные стрептококки, БГКП, термостойкие бактерии, стафилококки, клостридии.

3.  Микробиологическое исследование молока проводят и следующих случаях: 1) когда возникает подозрение, что оно может пред­ставлять опасность для здоровья людей, 2) в порядке контроля за санитарно-гигиеническим режимом доения и первичной обработки хранения и транспортировки, 3) в случае подозрения на обсемененность микроорганизмами, при наличии которых молоко не может перерабатываться в молочные продукты, 4) для установления микрофлоры, вызвавшей воспаление молочной железы и ее антибиотикоустойчивости.

В большинстве случаев микробиологическое исследование молока ограничивается определением общего количества бактерии и бродильного титра. При подозрении на обсеменение молока патогенными микроорганизмами проводятся специальные исследования в зависимости от вида предполагаемого возбудителя. Молоко необходимо исследовать немедленно после взятия пробы, в противном случае его следует охладить до 4—6° (не выше). На посуду с образцами молока для исследования наклеивают этикетки с указанием номера пробы, номера и размера партии продукта, дня и часа отбора пробы. На этикетке должна быть подпись лица, взявшего пробу, с указанием его должности. Если пробы молока отправляют в лабораторию, находящуюся за пределами предприятия (колхоза, совхоза), их пломбируют и опечатывают.

Чашечный метод.Для определения общего количества в молоке микробов исследуемый материал вносят в чашку Петри и заливают питательной средой в количестве 12—15 мл. При иссле­довании необходимо производить предварительное разведение мо­лока в стерильной воде. Разведения делают с таким расчетом, что­бы последнее из них содержало десяток клеток в 1 мл. Для посева на чашки Петри обычно используют три последних разведении. За­сеянные чашки помещают в термостат при температуре 37°. Под­счет выросших колоний производят через 24 и 48 часов. Число ко­лоний каждой чашки умножают на степень разведения молока. Из каждой пробы молока колонии следует подсчитывать на трех чашках и брать средние цифры. Сумму колоний во всех чашках делят на количество чашек и таким образом устанавливают показатель микробного обсеменения 1 мл молока.

Для определения качества молока и молочных продуктов важ­но установить не только общее количество содержащихся п них микробов, из которых некоторые обладают полезными качествами. но и выявить бактерии кишечной палочки (эшерихий), являющиеся санитарно-показательными микроорганизмами. Обнаружение этих бактерии в молоке, молочных продуктах и объектах, соприкаса­ющихся с молоком, указывает на неудовлетворительные условия дойки корон, нарушения правил обработки молока на фермах, за­грязнение его навозом, подстилкой, плохой подготовкой к доению вымени, доильного инвентаря, несоблюдение правил личной гиги­ены дояров или работников молочной промышленности,

Однако, сложность и многоэтапность исследований молока и оборудования на обсемененность коли-бактериями затрудняет осу­ществление систематического контроля за санитарным качеством молока и изготовленных из него продуктов. Поэтому мы предложи­ли для этой цели среду ПЖ-65, позволяющую в короткий срок дать ответ о степени обсеменения коли-бактериями молока, молочных продуктов и доильного оборудования.

Среда ПЖ-65 предназначается для выделении из молока, сли­вок, сметаны, творога, масла и сыров бактерий кишечной палочки и сальмонелл. Среду готовят по следующей прописи (в г): лактозы 20,0. фосфорно-кислого калия (двузамещенного) —3,0, питательно­го агара (в порошке) —50,0, стерилизованной желчи крупного ро­гатого скота — 100 мл, 1 %-ного спиртового раствора бриллиантовой зелени—2 мл. Указанные компоненты растворяют при подогреве и помешивании в 900 мл дистиллированной воды, устанавливают рН 7,2—7,3, разливают столбиком в пробирки по 5 мл, прогревают текучим паром при 100° в течение 15 минут, охлаждают до 45—46° и вносят в пробирки со средой разведения молока или молочного продукта, предварительно растертого в стерильной ступке с физио­логическим раствором хлорида натрия аС1, Высевы из молока и продуктов делают в разведениях 1:5, 1:10, 1 : 100, 1 : 1000 и т.д. Инкубируют в термостате при температуре 43—44^е.

При наличии в продукте эшерихий, даже в разведениях до 10"⁹ через 16-18 часов инкубирования происходит разрыв столбика среды, но первоначальный ее зеленый цвет не изменяется. При росте сальмонелл среда приобретает оливковый цвет, без разрыва ее массы. Грамположительные микроорганизмы на среде «ПЖ-65» не развиваются. 

Существует связь между возникновением стафилококковых заболеваний и употреблением в пищу молока больных маститом животных, В первичных посевах на мясо-пентонном агаре стафилококковые культуры образовывают золотистый, оранжевый, коричневыи, белый или серый пигмент. При пересевах стафилококков оттенки пигмента и интенсивность его образования изменяются. Показа­тели гемолиза (альфа или бета) у отдельных культур также не явля­ются постоянными, они колеблются в зависимости от свежести кро­ви, концентрации эритроцитов в агаре, толщины слоя среды на чашках Петри, температуры, длительности инкубирования и других ус­ловий. Нередко одна и та же культура патогенного стафилококка в зависимости от условий выращивания даст различные типы гемо­лиза. При травмировании у коров эпителия сосковых каналов неис­правными доильными аппаратами, вызывавшем воспаление молочной железы, или при повреждении молочной цистерны, стафилокок­ки высеваются из молока почти в 100% случаев.

Для выделения из молока стафилококков И. С. Загаевский предложил среду П-3. Для ее приготовления в 500 мл печеночного бульона растворяют 30,0 г хлористого натрия, 30,0 питательного агара (в порошке), 10.0 г глюкозы, 0,8 г углекислого натрия, 0,25 сорбината натрия. Смесь прогревают при 100 "С в течение 30 минут. Доводят рН до 7,3—7,4 и перед разливом в чашки Петри (при температуре среды 47—48° С) добавляют 40 мл свежей дефибринированной крови крупного рогатого скота. При этом отсутствует пре­имущество кроличьей кропи в реакции гемолиза патогенными стафилококками в сравнении с кровью крупного рогатого скота, Содержание в среде хлористого натрия свыше 6,5% замедляет ге­молиз эритроцитов стафилококками. Вокруг колоний патогенных стафилококков образуется просветление агара (зона гемолиза эритроцитов).

Одним из наиболее важных критериев дифференциации пато­генных стафилококков от сапрофитных является реакция плазмокоагулянии. Установлено, что при добавлении к 2 мл плазмы крови свиньи 2 капель бульонной культуры патогенного стафилококка или 5 капель молока из пораженных стафилококковым маститом долей вымени свертывание плазмы наступает при температуре 38—40° в течение 1 1/2 ч, при температуре 25—30° в течение 3—12 ч, при тем­пературе 20—22°С в течение 6—18 ч. Реакция плазмокоагуляции с цельной плазмой более демонстративна, чем с разведенной. Оп­тимальной для свертывания плазмы является температура 38° С Свертывание крови кролика и свиньи наступает почти в одинако­вые сроки. Патогенные стафилококки не коагулируют плазму крови больных животных, леченных антибиотиками, а также не свежую плазму.

4. Санитарная оценка молока при болезнях животных

Туберкулез.Наибольшую опасность представляет молоко животных при поражениях туберкулезом вымени, в котором всегда находится большое количество туберкулезных палочек. При легочной форме туберкулеза животных возбудитель первоначально об­наруживается в слюне, которая через пищеварительный тракт мо­жет попасть в навоз, а затем с кожи животных или подстилки — в молоко.

Туберкулезные микобактерии весьма теплостойки по сравне­нию с другими патогенными неспоровыми бактериями. Согласно нашим исследованиям туберкулезные палочки крупного рогатого скота инактивируют лишь при их нагреве до 85'' в течение 30 ми­нут, в твороге и сливочном масле они выживают до 3 меснцев, а в твердых сырах—около 8 месяцев (срок наблюдения).

Повышенная стойкость туберкулезных микобактерии связана с наличием у них восковидной плотной оболочки. Поэтому темпе­ратура и время в принятых режимах пастеризации молока не всегда обеспечивают гибель зтих бактерии.

В соответствии с действующими правилами молоко, полученное от животных с туберкулезным поражением вымени подлежит уничтожению под наблюдением ветнадзора. Молоко, полученное от животных, положительно реагирующих на туберкулин и не имеющих клинических признаков заболевания, подлежит кипячению и ис­пользованию в хозяйстве. Такое молоко может быть переработано на топленое масло, а обрат, полученный при переработке этого масла, после проварки используется в корм животным. Молоко, от нереагирующих на туберкулин животных, оздоравливаемого хо­зяйства, подвергают пастеризации при t85° в течение 30 минут ил 90°— 5 минут.

Бруцеллез.Бруцеллы в молоке размножаются медленно, а при температуре ниже 20° развитие их прекращается. Выживае­мость их в молочных продуктах довольно высокая. Так, в кисло­молочных продутах они сохраняют жизнеспособность до 2 недель, в брынзе— 1,5 месяца.

Наличие бруцелл в молоке определяют при помощи кольцевой пробы, которая основывается па наличии в молоке животных, больных бруцеллезом, соответствующих антител. В качестве антигена используют взвесь убитых бруцелл, окрашенных гематоксилином или другой краской. В результате добавления цветного антигена 13 молоко больной бруцеллезом коровы происходит склеивание нахо­дящихся там антител с антигеном. Образующийся комплекс анти­тело + антиген обладает свойством адсорбироваться на поверхности жировых шариков, которые при 37—38° поднимаются вверх, увлекая за собой и склеенные бактерии. Поэтому при положитель­ной реакции в верхнем слое сливок образуется синее кольцо окрашенных клеток бруцелл. При отрицательных результатах пробы верхний слой сливок не окрашивается, а молоко принимает цвет краски, которой был окрашен антиген. Согласно инструкции по борьбе с бруцеллезом молоко от коров. имеющих клинические признаки бруцеллеза и реагирующих на бруцеллизат кипятят в хозяйстве в течение 5 минут и используют внутри хозяйства. Молоко, от нереагируюших на бруцеллез коров, оздоравливающих хозяйств, подвергают пастеризации при темпе­ратуре 80° в течение 30 минут. В неблагополучных по бруцеллезу овцеводческих хозяйствах, овец не доят.

Ящур.При заболевании коров ящуром наблюдается уменьшение удоя, увеличение в молоке лейкоцитов, жира, а также альбумина, глобулина и кальция. Наряду с этим в молоке больных коров снижается количество витамина А и рибофлавина. Устойчивость ящурного вируса следующая: в свежем молоке при 37° он сохраняется 12 часов, при 5°— 12 дней, в молоке, охлажденном до 4°— 15 дней. При скисании молока вирус в нем инактивируется при воздействии повышенной кислотности.

Согласно инструкции по борьбе с ящуром при наложении карантина на неблагополучное по ящуру хозяйство, запрещается вывоз и использование молока и молочных продуктов в необезвоженном виде. Молоко, полученное от карантинированных по ящуру живот­ных, может быть допущено в пишу после пастеризации при 85" в течение 30 минут или кипячения в точение 5 минут. При осложне­нии ящура гнойным маститом молоко кипятят и уничтожают.