КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

 

Задачей микробиологического контроля на предприятиях молочной промышленности является определение различных микробиологических показателей.

 

1.1.1   Группы микробиологических критериев безопасности пищевых продуктов

1. Группа показателей санитарного состояния

Непосредственное выявление патогенных микроорганизмов (возбудителей пищевых инфекций) в пищевых продуктах невозможно из-за низкого их содержания в продукте по сравнению с содержанием сапрофитной микрофлоры. Поэтому при санитарной оценке пищевых продуктов используют косвенные методы, позволяющие определить уровень загрязнения человека выделениями человека. Чем выше этот уровень, тем вероятнее попадание в объект патогенных микроорганизмов – возбудителей кишечных инфекций.

Санитарная оценка пищевых продуктов проводится по двум микробиологическим показателям: общей бактериальной обсемененности (КМАФАнМ) и наличию бактерий группы кишечной палочки (БГКП).

Общая бактериальная обсемененность (КМАФАнМ) - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г или 1 см³ продукта.

Высокая бактериальная обсемененность пищевых продуктов свидетельствует о недостаточной термической обработке сырья, недостаточно тщательной мойке и дезинфекции оборудования, неудовлетворительных условиях хранения и транспортировки продукции.

Общую бактериальную обсемененность определяют в молочных продуктах, в которых отсутствует технически полезная микрофлора (микрофлора заквасок). Для определения этого показателя используют универсальные питательные среды: мясопептонный агар (МПА) или среду для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

Наличие бактерий группы кишечной палочки (БГКП) наблюдается во всех молочных продуктах (за исключением стерилизованных). БГКП объединяют представителей нормальной микрофлоры кишечника человека и относятся к семейству Enterobacteriaceae родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia. БГКП выполняют функцию индикатора фекального загрязнения и относятся к санитарно-показательным микроорганизмам.

Выбор БГКП в качестве санитарно-показательных микроорганизмов для оценки санитарного состояния пищевых продуктов не случаен. Санитарно-показательные микроорганизмы должны отвечать следующим требованиям:

·       Эти микроорганизмы должны являться представителями нормальной микрофлоры организма, в нем развиваться и размножаться;

·       Они должны в больших количествах выделяться из организма;

·       В окружающей среде они должны длительное время сохранять свою жизнеспособность, но не размножаться;

·       Определение этих микроорганизмов должно осуществляться простыми методами.

В нормативных документах (государственных, отраслевых стандартах (ГОСТ, ОСТ), технических условиях, требованиях СанПиНа) обычно указывается количество продукта, в котором БГКП не допускаются. При высоком уровне загрязнения продукта БГКП возрастает вероятность нахождения в нем патогенных микроорганизмов – возбудителей кишечных инфекций (дизентерии, брюшного тифа, холеры и др.). Для определения БГКП применяют накопительную среду Кесслера, а идентификацию этих бактерий проводят с использованием дифференциально-диагностической среды Эндо.

 

2. Группа условно-показательных микроорганизмов. К этой группе относятся микроорганизмы – возбудители пищевых отравлений, таких как Proteus vulgaris, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum.

В молочных продуктах, богатых белком (например, твороге, сыре) нормируется содержание коагулазоположительного золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus) – возбудителя пищевой интоксикации. При определении золотистого стафилококка используют элективные питательные среды: молочно-солевой (МСА) или желточно-солевой (ЖСА) агар.

 

3.    Группа патогенных микроорганизмов

Из патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах определяют сальмонеллы. Проводят исследования на наличие сальмонелл органы Санэпиднадзора. Обычно, сальмонеллы не допускаются в 25 г (см³) продукта.

Оля определения сальмонелл используют накопительные питательные среды (селенитовую, Кауфмана, Мюллера) и дифференциально-диагностические среды (Плоскирева, Левина).

 

4.Группа показателей микробиологической стабильности продукта. К этой группе относятся микроскопические грибы и дрожжи, которые, как известно, являются возбудителями порчи продукта. Этот показатель нормируется в молочных продуктах с растительными добавками. Динамику роста грибов и дрожжей определяют при установлении сроков годности и режимов хранения новых видов продуктов.

Кроме вышеперечисленных микробиологических показателе для прогнозирования качества выпускаемой молочной продукции целесообразно определять отдельные группы микроорганизмов, которые относятся к представителям технически вредной микрофлоры (липолитические, протеолитические бактерии) и полезной микрофлоры (молочнокислые и др. бактерии)

 

1.1.2   Организация микробиологического контроля

Микробиологический контроль осуществляется в лаборатории предприятия. При отсутствии микробиологической лаборатории на предприятии указанный контроль может осуществляться по хоздоговору с органами госсанэпиднадзора или лабораториями, аккредитованными для проведения микробиологических исследований.

Для проведения микробиологических исследований в лаборатории должен быть оборудован бокс, состоящий из двух помещений – собственно бокса и предбоксника. В боксе должны быть установлены бактерицидные лампы, количество которых определяют из расчета 2,5 вт/м². Корме того в лаборатории должно иметься следующее оборудование: термостаты (для культивирования микроорганизмов при определенной температуре), автоклав (для стерилизации питательных сред, посуды, инструментов), сушильный шкаф или печь Пастера (для стерилизации посуды), микроскопы (для определения качественного состава микрофлоры). Лаборатории молочных заводов должны быть аккредитованы государственной санитарно-эпидемиологической службой на право проведения исследований, характеризующих гигиенические показатели безопасности выпускаемой продукции.

При организации микробиологического контроля руководствуются «Инструкцией по микробиологическому контролю производства на предприятиях молочной промышленности, утвержденной 28.12.87 Госагропромом СССР, а также санитарными правилами и нормами СанПиНа 2.3.4. 551-96, государственными, отраслевыми стандартами и техническими условиями на различные группы молочных продуктов.

Микробиологическому контролю подлежат:

·             Сырье (например, сырое молоко), полуфабрикаты (например, закваски), готовая продукция. Такой контроль еще называют контролем технологического процесса. Он позволяет установить эффективность процесса пастеризации молока, выявить места инфицирования на различных этапах технологического процесса производства молочных продуктов.

·             Оборудование, трубопроводы, вспомогательные материалы, вода, воздух производственных помещений, тара, упаковочные материалы и др. Микробиологический контроль этих объектов позволяет судить о санитарно-гигиеническом состоянии производства и соблюдении санитарных норм и правил личной гигиены работников производства.

Так, готовая продукция (молоко, сливки, кисломолочные напитки) должны контролироваться микробиологической лабораторией предприятия не реже 1 раза в 5 дней, сметана и творог – не реже 1 раза в 3 дня, качество санитарной обработки оборудования должно оцениваться по каждой единице оборудования не реже 1 раза в 10 дней. Чистоту рук работников следует контролировать не реже 3 раз в месяц.

В приложении 1 приведена схема организации микробиологического контроля на примере производства кисломолочных напитков.

 

1.1.3               Характеристика питательных сред, используемых для микробиологического исследования молочных продуктов

Для микробиологического исследования молочных продуктов и проведения санитарно-бактериологического контроля условий производства используют натуральные (приготовленные из продуктов животного и растительного происхождения) плотные и жидкие питательные среды.

Плотные питательные среды готовятся из жидких путем внесения гелеобразующих веществ (агар-агара или желатина).

Агар-агар – полисахарид, не используемый микроорганизмами для питания. Получают его из морских водорослей. Плавится агар при температуре около 100⁰С и затвердевает при температуре около 40⁰С. Плотные питательные среды используют для количественного учета микроорганизмов (каждая клетка вырастает на плотной среде в виде изолированной колонии). Путем посева молочных продуктов и их разведений на плотные питательные среды определяют КМАФАнМ, содержание золотистого стафилококка, микроскопических грибов и дрожжей, количество молочнокислых, гнилостных бактерий, спор бактерий рода Bacillus и др. Содержание агар-агара в плотных питательных средах составляет около 2%.

Желатин – белок, который выделяют из костей и хрящей животных при их вываривании. Многие микроорганизмы, обладающие протеолитической активностью, могут гидролизовать желатин, а продукты гидролиза использовать в качестве источника питания. Способность разжижать среды с желатином является диагностическим признаком при идентификации микроорганизмов.

Питательные среды бывают универсальные (для культивирования микроорганизмов различных групп), накопительные, элективные (для накопления и выявления микроорганизмов определенных групп) и дифференциально-диагностические (для определения видовой принадлежности микроорганизмов).

В качестве универсальных питательных сред используют жидкие (например, мясопептонный бульон - МПБ) и плотные (например, мясопептонный агав (МПА) и среда Сабур).

Накопительные среды имеют жидкую консистенцию и используются для выявления микроорганизмов, содержание которых в продукте незначительное. Накопительные питательные среды используются для выявления наличия бактерий группы кишечной палочки -БГКП (среда Кесслера) и сальмонелл (среда Кауфмана, селенитовая среда). При наличии роста бактерий на накопительных питательных средах в дальнейшем, как правило, делается пересев на плотные дифференциально-диагностические питательные среды, которые используются для идентификации выросших на накопительных средах бактерий. Так, в качестве дифференциально-диагностической среды для идентификации БГКП используется среда Эндо.

Элективные (избирательные) питательные среды имеют плотную консистенцию. Примером элективной питательной среды может являться молочно-солевой агар, который используется для выявления в молочных продуктах золотистого стафилококка.

В заводских лабораториях для приготовления питательных сред обычно используют промышленно изготовляемые сухие среды, которые представляют собой гигроскопические порошки, легко растворяющиеся в воде. Некоторые питательные среды готовят по прописям из отдельных компонентов (молока, пептона, дрожжевого экстракта, питательных солей и т.д.).

После приготовления питательных сред их разливают в пробирки или колбы, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве. Наиболее часто автоклавирование ведется при  избыточном давлении 0,1 Мпа и, следовательно, температуре 121⁰С в течение 15-30 мин. Некоторые питательные среды стерилизуют при более низком избыточном давлении или текучим паром (не создавая избыточного давления).

 

2. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

 

Студенты знакомятся со схемой микробиологического контроля на предприятиях молочной промышленности. Готовят посуду, питательные среды для проведения микробиологического анализа.

 

2.1 Приготовление посуды для микробиологического анализа

Для проведения микробиологического анализа используют чашки Петри, которые герметично упаковываются в пергаментную бумагу и стерилизуются. Пипетки на 1 см³ закрывают ватными тампонами и также заворачивают в бумагу.

Стерилизация посуды осуществляется в автоклаве при избыточном давлении 0,1 Мпа в течение 30-40 минут или сухим жаром в сушильном шкафу или печи Пастера при 165-170⁰С в течение 1-1,5 часа.

Стерильную посуду следует хранить в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками в течение не более 30 суток.

 

2.2 Приготовление питательных сред из промышленно выпускаемых сухих сред

Заключается в растворении определенного количества порошка в воде, доведении полученной смеси до кипения и кипячении в течение 5 минут. Далее (при необходимости) среда фильтруется через ватно-марлевый фильтр и разливается в пробирки или колбы, которые закрываются ватно-марлевыми пробками. Далее среды стерилизуют в автоклаве. С использованием сухих сред готовят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), среду Сабуро, среду Кесслера, среду для определения мезофильный аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

 

2.3 Приготовление питательных сред из отдельных компонентов

2.3.1 Среды для культивирования молочнокислых бактерий

Обезжиренное молоко. Молоко отделяют от сливок, разливают в пробирки или колбы, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве при избыточном давлении 0,05 Мпа. Среду используют для изучения физиологических свойств и для группового количественного учета молочнокислых бактерий.

Эту среду используют также для получения лабораторной закваски из сухих и жидких заквасок и бактериальных концентратов.

 Агар с гидролизованным молоком. Вначале готовят гидролизованное молоко путем гидролиза стерильного обезжиренного молока с помощью фермента панкреатина при 45⁰С в течение 3-х суток в присутствии хлороформа. Полученный гидролизат разводят водопроводной водой (в соотношении 1:2). Затем вносят 1,5-2% агара и 2-3% мела в виде тонкого порошка. Среду стерилизуют. Агар с гидролизованным молоком используют для количественного учета молочнокислых бактерий в молочных продуктах.

 

2.3.2 Среда для количественного учета гнилостных бактерий

Молочный агар  готовят путем внесения 20% горячего стерильного обезжиренного молока в стерильный расплавленный 2% водный раствор агар-агара. Используется эта среда для количественного учета протеолитических и пептонизирующих бактерий (микрококков, маммококков).

 

2.3.3 Среды для выявления коагулазоположительных стафилококков

Основа – солевой агар: к мясопептонному бульону с рН 7,2-7,4 добавляют 2%-ного агара и 6,5%-ного хлористого натрия, расплавляют на водяной бане, при необходимости фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают мерным цилиндром по 100 см³ в колбы вместимостью 250 см³ и стерилизуют при 121⁰С в течение 30 минут. Получают солевой агар. Вместо МПБ можно использовать сухой питательный агар, добавив к нему 6,5% хлористого натрия.

Желточно-солевой агар. К расплавленному и охлажденному до 45⁰С солевому агару (основе) добавляют 20 см³ эмульсии яичного желтка. После полного размешивания желточно-солевой агар разливают в стерильные чашки Петри по 20 см³ и хранят в холодильнике 5-7 дней.

 Для приготовления эмульсии яичного желтка на дно стерильной чашки Петри помещают куриное яйцо, которое тщательно протирают ватой, смоченной этиловым спиртом. Стерильным пинцетом пробивают с двух противоположных сторон два отверстия. Через одно из этих отверстий из яйца полностью удаляют белок, а затем, несколько увеличив отверстие, выливают желток в стерильную колбу вместимостью 200 см³. Желток добавляют в колбу с 4-мя объемами стерильного физиологического раствора, затем содержимое тщательно встряхивают до получения гомогенной массы.

Молочно-солевой агар. К 100 см³ расплавленного и охлажденного до 45⁰С солевого агара вносят 10 см³ обезжиренного стерильного молока, тщательно размешивают и разливают тонким слоем в стерильные чашки Петри.

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЫРОГО И

ПАСТЕРИЗОВАННОГО МОЛОКА

(выполняется на двух занятиях)

Цель занятия: Знакомство с косвенными методами определения микроорганизмов и ингибирующих веществ в сыром молоке.

Освоение методов количественного учета микроорганизмов в питьевом молоке. Анализ полученных данных и оценка качества питьевого молока в соответствии с требованиями СанПиНа. Изучение качественного состава микрофлоры пастеризованного молока.

Оборудование, материалы: Проба пастеризованного молока, пробирки с 9 см³ стерильной воды, стерильные пипетки на 1 см³ и чашки Петри, пробирки с питательными средами: с МПА или средой для определения КМАФАнМ; со средой Сабуро; средой Кесслера с поплавками; со стерильным молоком; колбы на 250 см³ с водным 2% агаром; набор красок по Граму; фильтровальная бумага; бактериологические петли; предметные стекла; микроскопы; спиртовки; термостаты.

2.1 КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

2.1.1 Отбор проб молока

Молоко для микробиологического анализа тщательного перемешивают. Стерильным черпаком или пробоотборником отбирают около 50 см³ молока в стерильную колбу, которую затем закрывают ватно-марлевой пробкой. Если пробы предназначены для отправки в лабораторию, их необходимо охладить до 5…6⁰С. Хранить пробы при этой температуре можно не более 4 часов. Перед отправкой образцы пломбируют или опечатывают, оформляют сопроводительный документ, в котором указывают дату, час отбора пробы, температуру продукта, должность и подпись бравшего пробу.

2.1.2 Методы исследования сырого молока

Основными источниками попадания микроорганизмов в молоко являются вымя и кожный покров животных, руки доярок, оборудование, воздух и др. После доения молоко необходимо охладить до возможно более низких температур во избежание чрезмерного развития микроорганизмов в молоке в процессе его хранения.

Во время хранения молока изменяется количественный и качественный состав микрофлоры. Характер этих изменений зависит от температуры, продолжительности хранения, степени обсемененности и состава микрофлоры молока. Изменение вторичной микрофлоры проходит через определенные естественные фазы развития: бактерицидную фазу, фазу смешанной микрофлоры, фазу молочнокислых бактерий, фазу дрожжей и плесеней.

Основными факторами, определяющими гигиеническое качество сырого молока  являются:

·             Содержание патогенных микроорганизмов (микобактерий туберкулеза, бруцелл, сальмонелл, энтеропатогенных кишечных палочек, дизентерийных палочек (шигелл Зонне), коагулазоположительных стафилококков). При установлении эффективности пастеризации молока ориентируются на то, что допустимое максимальное количество этих микроорганизмов в сыром молоке должно быть не выше 10…100 клеток в 1 см³.

·             Содержание сапрофитных микроорганизмов. В зависимости от количества микроорганизмов в молоке судят о пригодности его для переработки в различные молочные продукты. Например, при переработке сырого молока в питьевое количество микроорганизмов в сыром молоке допускается до 1х10⁶ клеток в 1 см³. Повышенное содержание сапрофитных микроорганизмов приводит к различным порокам сырого молока (ослизнению и тягучести, преждевременному свертыванию, горькому, прогорклому, мыльному и щелочному вкусу, несвойственным молоку запахам, порокам цвета и т.д.).

·             Содержание соматических клеток. При воспалительных заболеваниях молочной железы в молоке появляется большое количество соматических клеток (например, лейкоцитов). Чем больше соматических клеток в молоке, тем выше содержание в нем возбудителей маститов (патогенных стафилококков, гемолитических стрептококков и т.д.).

·             Содержание ингибирующих веществ. Ингибирующие вещества, содержащиеся в молоке, делятся на естественные (собственно молочные ингибиторы, обусловливающие бактерицидные свойства молока) и попадающие в молоко извне (попадают в молоко при лечении, кормлении животных, с оборудования). К естественным ингибиторам относятся лизоцимы, а к ингибиторам второй группы – антибиотики, сульфаниламиды, пестициды, гербициды, остатки моюще-дезинфицирующих веществ.

Поступающее на переработку сырое молоко и сливки исследуют по редуктазной пробе. Этот метод относится к косвенным методам определения количества бактерий в молоке. Метод основан на восстановлении метиленового голубого или резазурина при 38⁰С окислительно-восстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. Чем дольше обесцвечиваются красители, тем выше класс молока (см. приложение 2).

К косвенным методам относится также определение ингибирующих веществ в сыром молоке. В качестве контроля используют образец с индикаторами, как и в редуктазной пробе. Опытом служит вариант с внесением метиленового голубого или резазурина и термофильного стрептококка. Если в молоке имеются ингибирующие вещества, то термофильные стрептококки в нем не размножаются, индикаторы не обесцвечиваются и молоко остается окрашенным (голубая окраска при использовании метиленового голубого и синефиолетовая – при использовании резазурина).

Редуктазную пробу и определение ингибирующих веществ, а сыром молоке проводят не резе 1 раза в 10 дней.

Содержание микроорганизмов в молоке можно также определять прямыми методами: посевом разведений молока на МПА непосредственно (при определении КМАФАнМ) и после пастеризации при 80…85⁰С в течение 15-20 минут (для определения спор бактерий).

2.1.3 Микрофлора и методы количественного учета

микроорганизмов в пастеризованном (питьевом) молоке

Поступившее на предприятие молоко подвергается различным технологическим приемам, направленным на уменьшение в нем содержания микроорганизмов. Наиболее часто используют очистку молока, охлаждение. Пастеризацию

Пастеризация – это тепловая обработка молока при температурах ниже температуры кипения. При производстве питьевого молока наиболее распространенным режимом является пастеризация при 76⁰С с выдержкой 20 секунд. Целью пастеризации является уничтожение патогенных микроорганизмов, а также инактивация ферментов, снижающих стойкость молока и вызывающих в дальнейшем пороки молочных продуктов. Эффективность пастеризации молока зависит от температуры, продолжительности пастеризации, степени бактериальной обсемененности молока и качественного состава микрофлоры.

Микрофлору, которая остается после пастеризации молока называется остаточной микрофлорой пастеризованного молока. Эффективность пастеризации является высокой, если количество оставшихся  бактерий составляет 0.01% от исходного содержания бактерий в молоке и низкой – при 1,5-2%. Сразу после пастеризации БГКП не допускаются в 10 см³ молока. В остаточной микрофлоре молока сразу после пастеризации содержатся в основном споровые формы бактерий.

После пастеризации молоко может дополнительно обсеменяться БГКП, психрофильными бактериями, мезофильными молочнокислыми стрептококками, термоустойчивыми палочками, дрожжами, уксуснокислыми бактериями (микрофлора вторичного обсеменения пастеризованного молока).

Контрольные вопросы

1.  Какие методы используют для определения общего количества микроорганизмов в молоке?

2. Как определяют эффективность пастеризации молока?

3. Как определяют коли-титр молока?

4. Какие методы вы знаете для определения молочнокислых бактерий в молоке и в чем их сущность?

5. Как определяют протеолитические, маслянокислые бактерии, дрожжи и плесневые грибы в молочных продуктах?

6. В чем сущность определения качества молока путем постановки пробы на редуктазу?