Last saved by: Work

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №6.
«Определение нитратов и нитритов» 
1. Цель и содержание 
Цель работы: освоить ионометрический и фотометрический методы определения нитратов и нитритов в мясе, субпродуктах и мясных изделиях. Содержание работы:
 - изучить ионометрический и фотометрический методы количественного определения нитратов и нитритов; 
- установить содержание нитрат- и нитрит-ионов в мясе, субпродуктах, мясных изделиях различного группового ассортимента; 
- оценить влияние компонентов рецептуры, способов подготовки сырья и доведения продуктов до кулинарной готовности на содержание нитратов и нитритов в мясных изделиях;
- по результатам исследований дать санитарно-гигиеническую оценку исследуемых образцов. 
2. Теоретическое обоснование 
Нитраты – соли азотной кислоты, широко распространены в окружающей среде, главным в почве и воде. Они являются естественным компонентом пищевых продуктов растительного происхождения. Концентрация нитратов в растениях колеблется в широких пределах, зависит от многих факторов, среди которых определяющим является неконтролируемое использование азотных удобрений и пестицидов. Установлено, что нитраты могут изменять активность обменных процессов, угнетать активность иммунной системы организма, снижать его устойчивость к отрицательному воздействию факторов окружающей среды. При избытке нитратов чаще возникают простудные заболевания, приобретающие хронический характер. В то же время нитраты не обладают выраженной токсичностью. Острые отравления наблюдаются у людей при случайном приеме 1– 4 г нитратов, доза 8– 14 г может оказаться летальной. ДСП нитратов для взрослого человека составляет 300 – 325 мг. Потенциальная токсичность нитратов заключается в том, что они могут при хранении сырья и пищевых продуктов, а также в пищеварительном тракте и при воспалительных процессах в мочевыводящей системе микробиологически восстанавливаться до нитритов и вызывать серьезные нарушения здоровья. Кроме того, нитраты могут восстанавливаться и чисто химическим путем, например, в результате реакции с оловом консервной банки. Механизм токсического действия нитритов на организм заключается в их взаимодействии с гемоглобином крови. В результате окисления двухвалентного железа образуется метгемоглобин, не способный связывать и переносить кислород, развивается клиническая картина гипоксии (обильное потение, синюшность кожи, одышка, головокружение). Допустимая суточная доза (ДСД) нитритов 0,2 мг/кг. Острое отравление отмечается при одноразовой дозе в 200 – 300 мг, летальный исход – 300 – 2500 мг. Несмотря на токсические свойства, нитрит натрия широко используется как прямая пищевая добавка в мясоперерабатывающем производстве. Применение нитрита натрия в технологии производства мясопродуктов объясняется его комплексным воздействием на качество готовых изделий. Нитрит натрия способствует образованию окраски, участвует в формировании специфического вкуса и аромата мясных продуктов, особенно солено-копченых, предотвращает развитие спор Clostridium botulinum , тормозит развитие окислительных процессов. Учитывая токсические свойства нитрита и возможность его участия в образовании канцерогенных нитрозаминов, содержание нитрита натрия в продуктах строго лимитируется и не должно превышать 50 мг/кг. Однако оно может оказаться завышенным и при соблюдении технологических норм введения нитрита натрия при отсутствии входного контроля на его содержание в мясном сырье, так как нитрит могут использовать в животноводстве при откорме свиней для снижения интенсивности обменных процессов и накопления питательных веществ в тканях животного. Принимая во внимание потенциальную опасность нитрата и сложность регулирования реакций образования нитрозопигментов, использование солей азотной кислоты при посоле мяса в нашей стране запрещено. В то же время не исключена вероятность превращения нитрита в нитрат, попадание его в мясопродукты с водой и при комбинировании в рецептурах сырья животного и растительного происхождения, что предопределяет необходимость контроля содержания солей азотной кислоты в готовых изделиях. Для контроля содержания в сырье и пищевых продуктах нитратов и нитритов используют фотоколориметрические, хроматографические, спектрофотометрические и химические методы. Ионометрический метод определения нитрат- и нитрит-ионов предусматривает использование ионоселективного (нитратного) электрода типа ЭМ-ЛО_3-01 путем индикации и измерения ЭДС электрода на иономере И-130 (или нитратомере). Иономер предназначен для измерения активности ионов водорода (рН), одновалентных и двухвалентных анионов и катионов (рХ), окислительно-восстановительных потенциалов в цифровой форме и в виде сигналов постоянного тока. Содержание нитрат-ионов можно фиксировать без предварительного измерения рН. На точность измерения не влияет присутствие фосфора, белков и жиров, но содержание хлористого натрия в исследуемых образцах не должно превышать 3,5%. Измерение ЭДС и определение концентрации нитратов проводится в водной вытяжке, полученной из пробы продукта после предварительной экстракции при интенсивном перемешивании смеси с последующим фильтрованием. Для исследования растворов с небольшими концентрациями нитрат- и нитрит-ионов используют метод добавок. В 50 см3 вытяжки измеряют ЭДС, затем в нее вводят нитрат калия так, чтобы массовая доля нитрата увеличилась до значений, соответствующих предварительно построенному калибровочному графику. По разнице значений рассчитывают искомую величину. Для определения содержания нитритов их окисляют персульфатом аммония до нитратов. Разность между найденным суммарным значением нитрат-ионов и их начальной концентрацией соответствует концентрации нитрит-ионов. 
Фотометрические методы применяют в ряде модификаций, основанных на той или иной химической реакции с образованием специфически окрашенных растворов. В частности используют метод, основанный на реакции нитрита с N-1-нафтилэтилендиамином дигидрохлорида и сульфаниламидом в фильтрате с удаленным белком с последующим фотоколориметрированием.
3. Аппаратура, реактивы и материалы 
Аппаратура: иономер И-130 или нитратомер; ионоселективный электрод на NO_3-ионы; электрод сравнения – хлорсеребряный; весы технические и аналитические; фотоэлектроколориметр или спектрофотометр; мясорубка; гомогенизатор; водяная баня, термометр. 
Материалы: конические колбы вместимость 100 и 250см3 , химические стаканы вместимостью 50 см3 ; мерный цилиндр на 100 и 250 см3 ; мерные колбы на 1 дм3 , 100, 200, 250, 500 и 1000 см3 ; пипетки на 2, 5, 10, 20, 25 и 30 см3 ; воронки; фильтровальная бумага, стеклянные палочки. 
Реактивы: 
 Для определения нитрат- и нитрит-ионов ионометрическим методом необходимы: нитрат калия ч. д. а.; водный 0,45% раствор сульфата цинка ZnSO4 ; водный раствор сульфата калия концентрацией (1/2 K2SO4) 1моль/дм3 ; водный раствор гидроксида натрия NaOH (0,1 моль/дм3 ); водный 8% раствор персульфата аммония (NH4)2S2O3. 
Для определения рабочего диапазона концентраций нитрат-ионов предварительно строят калибровочный график: навеску нитрата калия массой 10,1 г растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1 дм3 , доводят содержимое водой до метки. Получают раствор нитрата калия молярной концентрацией 10-1 моль/дм3 (pNO3=1). 
Методом последовательного разбавления из полученного раствора готовят серию стандартных растворов нитрата калия концентрацией 10^-2 , 10^-3 , 10^-4 и 10^-5 моль/ дм^3 (pNO_3 равны соответственно 2, 3, 4 и 5). В пять химических стаканов отбирают по 50 см3 стандартных растворов нитрата калия, в каждый стакан добавляют по 1 см^3 раствора сульфата калия. Погрузив электроды в стаканы, в каждом растворе регистрируют ЭДС элемента, составленного из нитратселективного и хлорсеребряного электродов. Перед началом измерений электроды промывают несколько раз дистиллированной водой. Измерения выполняют, переходя от разбавленных растворов к концентрированным. По результатам полученных измерений строят калибровочный график в координ (pNO3), откладывая по оси ординат значения Е (мВ), по оси абсцисс – соответствующие значения pNO3. 
2. Для определения остаточного нитрита в мясных продуктах требуются следующие реактивы: жёлтая кровяная соль ( калия гексацианоферрата (ΙΙ) тригидрат); ацетат цинка; ледяная уксусная кислота; тетраборат натрия Na_2B_4O_7 10H_2O; концентрированная соляная кислота плотностью 1,19 г/м^3 ; амид сульфаниловой кислоты; N-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлорид; растворы для осаждения белков: реактив Карреза Ι; реактив Карреза ΙΙ, насыщенный раствор буры; растворы для приготовления цветной реакции: раствор 1, раствор 11, раствор 111, основной, рабочий и стандартный растворы нитрита натрия для построения калибровочного графика. 
Приготовление растворов для осаждения белков. 
Реактив Карреза Ι: 106 г гесацианоферрата (ΙΙ) калия растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до 1000 см^3 . Реактив хранят в склянке из темного стекла не более 1 месяца.     Реактив Карреза ΙΙ: 220 г ацетата цинка и 30 см3 ледяной уксусной кислоты растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до 1000 см^3 . Реактив хранят не более 1 месяца. Насыщенный раствор буры: 50 г тетрабората калия растворяют в 1000 см^3 теплой дистиллированной воды и охлаждают до 20 ^оС. 
Приготовление растворов для проведения цветной реакции. 
Раствор 1: растворяют, подогревая на водяной бане, 2 г амида сульфаниловой кислоты растворяют в 800 см^3 воды. Охлаждают, при необходимости фильтруют и добавляют, перемешивая, 100 см^3 концентрированной соляной кислоты плотностью 1,19 г/см^3 , затем водой доводят объем до 1000 см^3 . 
Раствор 11: растворяют в воде 0,25 г N-1-нафтилэтилендиамина дигидрохлорида C_10H_7NHCH_2CH_2NH_2 2HCl и доводят объем водой до 250 см^3. Хранят раствор в склянке из темного стекла в холодильнике не более недели 
Раствор 111. Разбавляют 445 см^3 концентрированной соляной кислоты плотностью 1,19 г/см^3 водой до 1000 см^3. 
Приготовление стандартных растворов нитрита натрия. 
Для приготовления основного раствора нитрита натрия точно 1 г нитрита натрия растворяют в воде, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 500 см3 , доводят водой до метки и перемешивают. Для химически чистого 99% реактива величину навески (г) вычисляют по формуле:

Для приготовления рабочего раствора 25 см^3 основного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см^3, доводят водой до метки и перемешивают. Из полученного раствора готовят серию стандартных растворов: 2, 5 и 10 см^3 рабочего раствора пипеткой вносят в три мерные колбы вместимостью 100 см^3 , доводят водой до метки и перемешивают. 
Стандартные растворы содержат в 1 см^3 соответственно 1, 2,5 и 5 мкг нитрита натрия. Готовят три серии стандартных растворов, начиная каждый раз с приготовления основного раствора из новой навески нитрита натрия. Стандартные растворы нитрита натрия не стойки, поэтому их готовят непосредственно перед построением калибровочного графика.
Построение калибровочного графика. 
Берут четыре мерные колбы вместимостью 100 см^3. В первую колбу для приготовления контрольного раствора пипеткой вносят 10 см^3 воды, а в остальные три колбы по 10 см^3 стандартных растворов, содержащих 1, 2,5 и 5 мкг нитрита натрия в 1 см^3 раствора. В каждую колбу добавляют по 50 см^3 воды, по 10 см^3 раствора 1 и по 6 см^3 раствора 111 для проведения цветной реакции. После этого объем раствора в колбах перемешивают и выдерживают в темном месте 5 мин, затем добавляют 2 см^3 раствора 11 для проведения цветной реакции, перемешивают и выдерживают в темном месте 3 – 10 мин при 20^оС.
Растворы в колбах доводят водой до метки и перемешивают. Интенсивность красной окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 538 нм или на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 1 см в отношении контрольного раствора. По полученным средним данным из трех стандартных растворов строят калибровочный график (рисунок 1), откладывая на оси абсцисс концентрацию нитрита натрия (мкг в 1 см^3 окрашенного раствора) , а на оси ординат соответствующую оптическую плотность (D). Калибровочный график должен проходить через начало координат.

4. Указания па технике безопасности 
К работе допускаются студенты, прошедшие инструктаж по технике безопасности работы в химических лабораториях, работы с электроприборами и аппаратурой, о чем должна быть соответствующая запись в журнале. 
5. Организация работы 
Работа выполняется бригадами из 3-4 студентов по предложенным преподавателем вариантам образцов мяса различных видов убойных животных и птицы, субпродуктов 1 и 11 категории, колбас, соленых штучных изделий и консервов.
Лабораторная работа выполняется в два этапа. На первом 4-х часовом занятии изучаются методики определения нитратов и нитритов в мясных продуктах, студенты знакомятся с работой приборов, готовят основные растворы и строят калибровочные графики. На втором 4-х часовом занятии студенты проводят подготовку образцов и их исследование на содержание нитрат- и нитрит-ионов, выполняют необходимые расчеты, делают выводы о соответствии по этим показателям мяса и мясопродуктов санитарногигиеническим требованиям и защищают работу.
6. Методика и порядок выполнения работы 
6.1 Подготовка проб. С колбасных изделий снимают оболочку, с фаршированных колбас и языков в шпике – поверхностный слой шпика и оболочку, с окороков, рулетов, корейки и грудинки – поверхностный слой шпика. Затем пробы дважды измельчают на мясорубке с диаметром отверстий решетки 3 – 4 мм. Продукты, преимущественно состоящие из шпика с промежуточными слоями мышечной ткани, измельчают полностью. Подученный фарш тщательно перемешивают, помещают в стеклянную или пластмассовую банку вместимостью от 200 до 400 см^3, заполнив ее полностью, закрывают крышкой. Пробу хранят в холодильнике при температуре 4 ^оС до окончания анализа. Анализ проводят не позднее, чем через 24 часа после отбора проб. Пробу сырых продуктов анализируют сразу после измельчения. 
6.2.Определение нитрат- и нитрит-ионов ионометрическим методом. 
Для определения нитрат-ионов в коническую колбу вместимостью 250 см^3 помещают навеску продукта массой 10 – 20 г, взятую с точностью до 0,01 г, добавляют 100 см^3 подогретой до 50 – 60 ^оС дистиллированной воды и экстрагируют при непрерывном перемешивании в течение 30 минут. Содержимое колбы охлаждают и фильтруют через бумажный фильтр в коническую колбу. В полученном мутном растворе осаждают белки. Для этого добавляют к фильтрату 2,5 см^3 раствора гидроксида натрия молярной концентрацией 0,1 моль/дм^3 и 10 см^3 раствора сульфата цинка массовой долей 0,45%, нагревают 5 минут на водяной бане при температуре кипения, охлаждают колбу и полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат и промывные воды после промывания осадка белков на фильтре собирают в мерную колбу на 100 см^3 и доводят объем до метки раствором сульфата калия молярной концентрацией 1 моль/дм^3 . В прозрачном фильтрате измеряют ЭДС, по величине которой на калибровочном графике находят начальное содержание нитрат-ионов в растворе. Для определения нитрит-ионов их окисляют персульфатом аммония до нитратов. К 25 см^3 фильтрата добавляют 0,5 см^3 раствора персульфата аммония массовой долей 8%, энергично перемешивают и через 5 минут измеряют ЭДС, по величине которой находят концентрацию нитрат-ионов после окисления нитрит-ионов, используя калибровочный график. Разность между найденным суммарным содержанием нитрат-ионов и начальной их концентрацией равна концентрации нитрит-ионов, содержащихся в исследуемом растворе. Содержание нитрат-ионов (мг%) в мясе и мясных продуктах находят по формуле:

6.З.Определение содержания нитритов фотометрическим методом
В коническую колбу вместимостью 250 см^3 помещают 10 г подготовленной к анализу пробы, взвешенной с точностью до 0,001 г, добавляют последовательно 5 см^3 насыщенного раствора буры и 100 см^3 воды температурой не ниже 70 °С.
Колбу с содержимым нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин, периодически встряхивая, затем охлаждают до 20°С и последовательно добавляют по 2 см^3 реактива Карреза I и реактива Карреза II, тщательно перемешивая после каждого добавления.
Переливают содержимое в мерную колбу на 200 см^3, доводят объем водой до метки, перемешивают и выдерживают 30 мин при комнатной температуре.
Осторожно сливают верхний слой жидкости и фильтруют его через гофрированную фильтровальную бумагу, получая прозрачный раствор.
Для проведения цветной реакции 20 см3 полученного безбелкового фильтрата вносят пипеткой в мерную колбу на 100 см3, добавляют 10 см3 раствора 1. Содержимое колбы перемешивают и выдерживают 5 мин в темном месте. Затем добавляют 2 см3 раствора 2, перемешивают и выдерживают в темном месте в течение 3 мин при 20°С. Раствор в колбе доводят до метки, перемешивают и измеряют интенсивность красной окраски на спектрофотометре при длине волны Я =538 нм или на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 1 см в отношении контрольного раствора.
Параллельно проводят контрольный опыт на реактивы, помещая в мерную колбу на 200 см3 вместо 10 г пробы 10 см3 воды.
Если оптическая плотность превышает максимальную оптическую плотность на калибровочном графике, то цветную реакцию проводят с меньшим количеством фильтрата.
Содержание нитрита вычисляют по формуле:

где X - содержание нитрита в 100 г продукта, мг; с - количество нитрита в 1 см^3 окрашенного раствора, найденное по калибровочному графику, мкг; т„ - масса навески продукта, г; V - объем фильтрата, взятый для фотометрического измерения, см^3.
За конечный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, допустимые расхождения между которыми не должны превышать 0,2 мг. Вычисление проводят с точностью до 0,1 мг в 100 г продукта.
На основании полученных данных по обнаружению и количественному определению в исследуемых образцах нитратов и нитритов необходимо сделать выводы соответствии их содержания требованиям по безопасности СанПиН, а также о сравнимости результатов, полученных разными
методами.
7. Содержание отчета и его форма
В содержание отчета о работе должны быть включены следующие разделы:	тема, цель, методики проведения опытов, результаты
экспериментальных исследований с их математической обработкой, выводы. Результаты работы оформляются в виде таблиц и текста.
8. Контрольные вопросы к защите работы
1.	Источники нитратов и нитритов в пищевых рационах.
2.	В чем заключается потенциальная токсичность нитратов?
3.	Какие дозы нитратов могут вызвать острое отравление и летальный исход?
4.	Каковы ДСД и ДСП нитритов?
5.	Механизм токсического действия нитритов на организм человека.
6.	Сколько нитритов получает человек, потребляя ежедневно 50-100 г колбасных изделий? Как этот согласуется с ДСП нитритов?
7.	Роль нитритов в технологии производства колбас, солёных штучных изделий и фаршевых консервов.
8.	Технологические нормы введения и контроля остаточного содержания нитрита в мясных продуктах.
9.	Какие Вы знаете методы обнаружения и количественного определения нитратов и нитритов в мясе и мясных продуктах?
10.	Как готовят пробы для проведения таких исследований?
11.	В чем суть ионометрического метода определения нитрат- и нитрит-ионов?
12.	С какой целью и как строят калибровочный график?
13.	Как проводят определение нитрат-ионов ионометрическим методом и как рассчитывают их содержание?
14.	Каким образом определяют содержание нитрит-ионов ионометрическим методом?
15.	На чем основан фотометрический метод определения остаточного нитрита в мясных продуктах?
16.	Перечислите основные этапы исследования при определении нитритов фотометрическим методом?
17.	Как рассчитать содержание остаточного нитрита в мясных продуктах по результатам фотометрических измерений?