Лекция 3.

Лекция 3.

Биохимические основы токсического действия веществ

В зависимости от цели токсикометрические исследования проводятся по-разному, но для решения задач гигиенической регламентации методические приемы, условия проведения и оценка результатов унифицированы.

Исследование токсичности веществ начинается с изучения смертельных эффектов в острых опытах. Проникновение веществ в организм осуществляется при вдыхании (ингаляционный путь), введении в желудок, нанесении на кожные покровы и слизистые оболочки. Для изучения сравнительной токсичности соединение вводится внутрибрюшинно. В опытах на животных (белые крысы массой 180-240 г, белые мыши массой 18-29 г) определяют концентрацию (дозу), вызывающую гибель 50 % стандартной группы подопытных животных. CL50 и DL50 являются статистическими величинами со средней ошибкой и доверительными интервалами. В связи с этим в каждой группе количество животных должно быть не менее 6, желательно обоего пола и двух видов. Токсичность вводимого вещества в известной степени зависит от ряда факторов (концентрации и объема вводимого вещества, рН, температуры окружающей среды и др.). Поэтому каждый путь поступления соединений в организм требует определенных условий.

         При оценке степени токсичности при энтеральном пути поступления наиболее часто вещество вводится непосредственно в желудок с помощью металлических или пластмассовых зондов. Введение соединений производится через 3 ч после кормления, вводимый объем не должен превышать для мышей 1 мл, для крыс - 5 мл. Кормление животных осуществляется через 3 ч после введения вещества. Изучаемое соединение вводится в чистом виде. Если это невозможно, то используются растворители. Обычно такие вещества вводятся в водных растворах, плохо растворимые соединения - в растительном масле, в виде суспензии в 1-2 %-м растворе крахмала. Следует помнить, что острая токсичность может существенно меняться в зависимости от используемого растворителя. Поэтому используемый растворитель обязательно вводится контрольной группе животных.

         Поступление вредных химических веществ через дыхательные пути в производственных условиях играет ведущую роль в возникновении профессиональных 36 заболеваний (отравлений). В лабораторных условиях используются два способа ингаляционного воздействия на лабораторных животных химическими веществами - статический и динамический.

         Статический способ используется для ориентировочных оценок степени токсичности летучих веществ при создании постоянной концентрации в замкнутом пространстве (специальные камеры или эксикаторы). Срок экспозиции для мышей - 2 ч, для крыс, морских свинок, кроликов - 4 ч. Основными недостатками данного метода являются быстрое накопление в невентилируе-мом пространстве углекислого газа, трудности в поддержании концентрации в камере на расчетном уровне.

Динамический способ позволяет обеспечить непрерывную подачу вещества в камеру, что создает условия для поддержания концентрации соединения на относительно постоянном уровне и обеспечивает необходимый воздухообмен.

Определение порога острого действия при однократном воздействии по изменению интегральных показателей проводится с использованием не менее 12 мелких лабораторных животных на одну концентрацию (дозу), как правило, применяется не менее трех концентраций. Оценка функционального состояния экспериментальных животных проводится через 4 ч после затравки, а затем на 2-й, 4-й и 8-й день опыта. При этом учитываются максимальные отклонения величины исследуемого показателя. Определение порога вредного действия по большинству специфических показателей регламентируется методическими указаниями, утвержденными Минздравом России.

В производственных условиях наряду с энтеральным и ингаляционным путями возможно поступление химических веществ через кожные покровы - перкутантный путь. В практическом плане большое значение имеет определение кожно-резорбтивного и раздражающего действия. Предварительная оценка кожнорезорбтивного действия производится на мелких лабораторных животных путем погружения хвоста на 2/3 длины в исследуемый раствор. Экспозиция для белых мышей - 2 ч, крыс - 4 ч. При отсутствии симптомов интоксикации аппликации веществ продолжаются в течение 10 дней с последующим наблюдением на протяжении 3-х недель. При наличии резор-бтивного действия производится количественная оценка степени токсичности. С этой целью животные фиксируются на специальном станке и на заранее выстриженный участок кожи наносят исследуемое соединение в определенной дозе. В зависимости от поставленной задачи при исследовании кожно-резорбтивного действия могут быть определены средняя смертельная концентрация или величина порога.

Исследование местного раздражающего действия при аппликации на кожу проводится на двух видах экспериментальных животных. Используются кролики и морские свинки светлой масти.

Количество животных - не менее 10 особей в группе. Участок аппликации составляет для кроликов 7x9 см, для морских свинок 5x5 см. За два дня до эксперимента тщательно выстригают участки шерсти по обе стороны от позвоночника, оставляя шерстяной покров между участками шириной 2 см. Правый бок служит для аппликации, левый - для контроля. На время экспозиции животных фиксируют для исключения слизывания вещества с кожи. Время экспозиции - 4 ч. Исследуемое вещество наносится на кожу из расчета 20 мг/см2 . Как правило, соединение наносят на кожу в чистом виде. Если это невозможно, то используют дистиллированную воду или модельную среду, имитирующую состав потово жидкости. Оставшееся после окончания эксперимента вещество удаляется теплой водой с мылом. Реакцию кожи регистрируют через 1 и 15 ч после однократной аппликации. Функциональные нарушения кожи характеризуются появлением выраженных в разной степени эритемы, отека, трещин, изъязвлений, а также изменением температуры кожи. Степень выраженности раздражающего действия вещества на кожные покровы определяют по классификации, включающей 11 классов (0 - отсутствие действия, 10 - растворы вещества слабее 5 % вызывают некроз).

Исследование местного действия вещества на слизистую оболочку глаза проводится при закапывании в конъюктивальный мешок 1 капли соединения. Твердые вещества вносят в количестве 50 мг (дисперсность частиц до 10 мкм). В дальнейшем в течение двух часов наблюдают за прозрачностью роговицы и слизистой оболочки. Развитие помутнения роговицы, острое воспаление слизистой оболочки с последующим рубцеванием век свидетельствует о наличии у вещества резко выраженного раздражающего эффекта.

В условиях подострого (на протяжении месяца) эксперимента проводят исследования, направленные на выявление наиболее чувствительных к воздействию токсичных веществ органов и систем экспериментальных животных. Это позволяет более адекватно подойти к выбору концентраций при проведении хронического эксперимента. Опасность токсичных веществ для человека в значительной мере предопределяется их способностью к кумуляции, поэтому изучение кумуляции является обязательным условием при гигиеническом регламентировании химических соединений. Наиболее распространенные в промышленной токсикологии методы оценки кумуляции основаны на определении усредненного суммарного количества вещества, полученного животным до появления определенного эффекта в подостром опыте, и сопоставлении этого количества с однократной средней эффективной дозой.

В настоящее время в токсикологии принято несколько методов оценки кумуляции. С помощью метода, предложенного Каганом, животным ежедневно вводят вещество в долях от установленной DL50 (1/5, 1/10, 1/20, 1/200). Данный метод позволяет прогнозировать опасность развития хронического отравления. Опыт по развернутой схеме продолжается 4 месяца. Более быстрым является тест «субхронической интоксикации».

Более полная информация о кумулятивной активности соединений, развитии хронической интоксикации при воздействии химических веществ может быть получена при постановке длительных экспериментов.

Исследование хронического действия проводится на одинаковых по количеству опытных группах с соответствующим контролем. Опыты проводят на белых крысах, а при выраженных межвидовых различиях и на более чувствительном виде животных. Воздействие соединением осуществляется 4 ч в день 5 раз в неделю на протяжении четырех месяцев; пятый месяц - период восстановления. Как правило, проводится исследование трех концентраций с установлением пороговой и недействующей. В зависимости от типа действия вещества применяют комплекс функциональных, биохимических, морфологических и других показателей. Каждый показатель исследуют не менее чем на 12 животных. Оценка состояния экспериментальных животных проводится в динамике: первое обследование - через 2 недели, далее - ежемесячно.

Специфика и механизм токсического действия вредных веществ Взаимодействие между токсичными веществами и живыми организмами имеет два аспекта:

 - действие токсичных веществ на организм - токсикодина-мическая фаза;

- действие организма на токсичные вещества - токсикоки-нетическая фаза.

Понятие «химической травмы»

Острые отравления целесообразно рассматривать как «химическую травму», развивающуюся вследствие внедрения в организм токсической дозы чужеродного химического вещества. Последствия, связанные со специфическим воздействием на организм токсичного вещества, относятся к токсикогенному эффекту химической травмы. Он носит характер патогенной реакции и наиболее ярко проявляется в ранней стадии острых отравлений - токсикогенной, когда токсический агент находится в организме в дозе, способной оказывать специфическое действие. Одновременно могут включаться патологические процессы, лишенные «химической» специфичности. Ядовитое вещество играет роль пускового фактора. Примерами являются гипофизарно-адреналовая реакция (стресс-реакция), «централизация кровообращения» и другие сдвиги, которые относятся к соматогенному эффекту химической травмы и носят вначале характер защитных реакций. Они наиболее ярко проявляются в соматогенной стадии острых отравлений, наступающей после удаления или разрушения токсического агента, в виде поражения структуры и функции различных органов и систем организма.

Таким образом, общий токсический эффект является результатом специфического токсического действия и неспецифических реакций организма.

В токсикогенной фазе отравлений выделяют два основных периода: период резорбции, продолжающийся до момента достижения максимальной концентрации токсичного вещества в крови, и период элиминации, от этого момента до полного очищения крови от яда (рис. 4).

С точки зрения токсикодинамики специфическая симптоматика отравлений, отражающая «избирательную токсичность» ядов, наиболее ярко проявляется в токсикогенной фазе, особенно в период резорбции.

Для последнего характерно формирование тяжело протекающих патологических синдромов острых отравлений, таких, как экзотоксический шок, токсическая кома, асфиксия и др. В соматогенной фазе обычно развиваются патологические синдромы, лишенные выраженной токсикологической специфичности, они трактуются как осложнения острых отравлений - это пневмония, острая почечная недостаточность, сепсис и пр.

Теория рецепторов токсичности

Представление о рецепторе как месте конкретного приложения и реализации токсического действия яда до настоящего времени остается недостаточно ясным, несмотря на то, что эта идея была выдвинута Дж. Ленгли более ста двадцати лет назад. Сам термин «рецептор» в токсикологическом понимании был предложен в начале 20-го века немецким ученым Эрлихом. Термин получил научное обоснование после количественных исследований А. Кларка (1937), показавшего, что между чужеродными веществами и их рецепторами возникает связь, повидимому, аналогичная взаимодействию субстрата со специфическим ферментом.

Ферменты - биологические катализаторы, присутствующие во всех живых клетках и осуществляющие превращения веществ в организме, тем самым направляя и регулируя его обмен веществ. Ни один процесс в организме не обходится без участия ферментов: так, внутриклеточное дыхание регулируется оксидазами; в усвоении белков участвуют протеназы, жиров - липазы, углеводов - киназы и фосфодазы и т. д. Всего в организме человека содержится до 1000 различных ферментных систем, катализирующих различные процессы. В то же время абсолютное количество каждого фермента в клетках организма крайне мало, поэтому выведение ферментов из строя достигается небольшими количествами токсичных соединений.

Оказалось, что во многих случаях рецепторами действительно являются ферменты. Например, оксигруппа серина, входящая как составная часть в молекулу фермента ацетилхолинэстеразы, служит рецептором фосфорорганических инсектицидов, образующих с этим ферментом прочный комплекс.

Кроме ферментов, рецепторами первичного действия ядов являются аминокислоты, нуклеиновые кислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды, витамины. Рецепторами часто бывают наиболее реакционно способные функциональные группы органических соединений, такие, как сульфгидрильные, гидро-ксильные, карбоксильные, амин- и фосфорсодержащие, которые играют жизненно важную роль в метаболизме клетки. Наконец, в роли рецепторов токсичности выступают различные медиаторы и гормоны.

Таким образом, логичным является предположение известного токсиколога Э. Альберта, что любое химическое вещество для того, чтобы производить биологическое действие, должно обладать, по крайней мере, двумя независимыми признаками: 1) сродством к рецепторам, 2) собственной физико-химической активностью. Под сродством подразумевается степень связи вещества с рецептором, которая измеряется величиной, обратной скорости диссоциации комплекса «вещество + рецептор».

Наиболее элементарное представление о ней дает простая оккупационная теория Кларка, выдвинутая им для объяснения действия лекарств: токсическое действие вещества пропорционально площади рецепторов, занятой молекулами этого вещества. Максимальное токсическое действие вещества проявляется тогда, когда минимальное количество его молекул способно связывать и выводить из строя наиболее жизненно важные клетки - мишени. Дело не столько в количестве пораженных ядом рецепторов, сколько в их значимости для жизнедеятельности организма. Немаловажной является скорость образования комплексов ядов с рецепторами, их устойчивость и способность к обратной диссоциации, что нередко играет более важную роль, чем степень насыщения рецепторов ядом. Таким образом, современная теория рецепторов токсичности рассматривает комплекс «яд + рецептор» с точки зрения их взаимодействия. Считают, что ковалентные связи ядов с рецепторами прочны и труднообратимы. К счастью, количество токсичных веществ, способных образовывать ковалентные связи невелико. К ним относятся, например, препараты мышьяка, ртути и сурьмы. Большинство же известных в настоящее время токсичных веществ и лекарственных средств взаимодействует с рецептором за счет более лабильных, легко разрушающихся связей - ионных, водородных, вандер-ваальсовых, что дает возможность их успешного удаления из организма.

Плодотворной оказалась идея Эрлиха о существовании высокой специфичности первичной реакции взаимодействия яда и клетки. Именно в этих случаях можно говорить о взаимодействии между ядом и рецептором как об отношении, напоминающем «ключ к замку» по Эрлиху.

Однако в токсическом действии многих веществ отсутствует строгая избирательность. Их вмешательство в жизненные процессы основано не на специфических химических воздействиях с определенными клеточными рецепторами, а на взаимодействии со всей клеткой в целом. Этот принцип, вероятно, лежит в основе наркотического действия разнообразных органи ческих и неорганических веществ, общим свойством которых является то, что они неэлектролиты. Для обозначения всех эффектов, которые прямо определяются физико-химическими свойствами вещества, предложен термин «неэлектролитное действие». Такое действие иногда называют «физической» токсичностью.

Токсическое действие большинства веществ включает как неспецифические «физические», так и специфические «химические» компоненты и развивается по смешанному варианту.

Токсикокинетика

Токсикокинетика отвечает на вопрос: что происходит с веществом в организме. В этом разделе рассматриваются пути поступления вредных веществ в организм, их транспорт и распределение, биотрансформация и выделение.

Структура и свойства биологических мембран

Поступление чужеродных веществ в организм, их распределение между органами и тканями, биотрансформация (метаболизм) и выделение предполагают их проникновение (транспорт) через ряд биологических мембран.

Мембранные системы организма имеют одинаковое строение, но отличаются по функциональным свойствам. Они представляют собой подвижные структуры, образованные белково-фосфолипидными комплексами и обладающие ограниченной проницаемостью для различных соединений. В настоящее время за основу принимается гипотеза трехслойной мембраны Доусона - Даниелли.

Два белковых слоя, из которых один обращен в сторону цитоплазмы, а другой - наружу, заключают слой двойного липида (рис. 5). Снаружи липидных слоев с плавающими в них белками находится «карбогидратная шуба», состоящая из разных олигосахаридов, полимеров, включающих десятки типов моносахаридов, в том числе глюкозу. Одна из предполагаемых функций этой «шубы» заключается в том, что она способна отличать клетки собственного организма от чужих. Двойной липидный слой составляет структурный каркас мембраны. Молекулы фос-фолипида ориентированы таким образом, что их гидрофильные группы направлены в сторону белка, а гидрофобные поверхности соприкасаются. Толщина каждого слоя 2-4 нм.

Предполагают, что в клеточных мембранах существуют ультрамикроскопические поры, образованные гидрофильным веществом, причем мембраны и поры имеют определенные электрические заряды.

На мембране или внутри нее могут располагаться системы ферментов, состоящие из белковых молекул. Белки, связанные только с поверхностью мембраны (внешней или внутренней), называют «внешними». Белки, которые проникают внутрь, называют «внутренними». Мембрана - не статичная структура. Соотношение липидов и белков в ней легко изменяется в соответствии с функциональными потребностями. Внутри структуры мембраны у липидов и белков довольно большая свобода передвижения.

Изучение функций клеточных и внутриклеточных мембран позволило выделить специальную группу веществ, оказывающих специфическое мембранотоксическое действие, так называемые мембранотоксины. К их числу относят экзогенные и эндогенные вещества, обладающие фосфолипазной активностью, в результате которой происходит дезорганизация и разрушение основной жидкокристаллической структуры мембран с последующей гибелью клеток. С другой стороны обнаружены некоторые соединения, способствующие стабилизации мембран (холестерин, кортизон, аминазин, салицилаты).

Повреждение мембранных структур клеток является одной из основных причин нарушения их жизнедеятельности. Существует несколько механизмов повреждения мембран. Наиболее существенны четыре: разрушение собственной фосфолипазой, активируемой ионами кальция; перекисное окисление, активируемое ионами Fe2+, ультрафиолетовым излучением и кислородом; механическое повреждение и разрушающее действие антител.

При острых отравлениях наиболее распространенной причиной повреждения является перекисное окисление липидов в мембранах митохондрий, липосом и пр., в результате чего происходит увеличение проницаемости мембран для ионов, в первую очередь Н+ (или ОН- ), затем K + , Na+ , Ca2+ . Следствием этого могут быть осмотические эффекты и разрывы мембран с выходом ферментов. Дальнейшее окисление мембран приводит к полному их разрушению и гибели клеток.

Повреждение мембран при гипоксии, сопровождающее многие заболевания химической этиологии, связано с недостатком энергии, выделяющейся при метаболизме АТФ. Механизм повреждения, вероятно, таков: гипоксия — деэнергизация и падение мембранного потенциала 51 митохондрий — выход Са2+ — активирование фосфолипазы — гидролиз фосфолипидов — увеличение ионной проницаемости — разобщение окислительного фосфорилирования.

Таким образом, повреждение мембранных структур происходит по универсальным механизмам, которые приводят к изменению их проницаемости для ионов, что в свою очередь обусловлено уменьшением или увеличением поверхностного заряда на мембране и снижением или повышением степени гидрофобности липидной фазы мембран. Оба эти фактора действуют одновременно, хотя их относительный вклад в итоговое изменение проницаемости мембран в разных случаях различен. Эти же факторы определяют, в конечном счете неспецифическое действие на проницаемость мембран различных соединений, например таких, как стероиды, белки и многие другие природные соединения.

Транспорт веществ через мембраны

Вопрос о прохождении веществ через мембраны достаточно сложен, так как при этом приходится учитывать не только функциональные особенности самих мембран, но и определенную роль протоплазмы и клеточных белков.

Мембрана - не просто пассивный барьер. Некоторые вещества проходят непосредственно через мембрану либо путем растворения в ней, либо путем химического взаимодействия с ее веществом.

Однако частично обмен осуществляется через поры. Они не обязательно являются каналами с фиксированным положением. Живая мембрана реагирует на изменяющиеся условия, открывая или закрывая определенные поры, что позволяет пропускать молекулы массой от 100 до 60000.

Транспорт веществ через мембраны осуществляется в результате следующих процессов:

- пассивные: диффузия сквозь поры; диффузия путем растворения в компонентах мембраны; ускоренная диффузия;

- активные: активный транспорт; пиноцитоз.

Диффузия представляет собой движение молекул или ионов из области более высокой концентрации или электрического заряда в область низкой концентрации или заряда («под гору»). Скорость диффузии вещества (СД), согласно закону Фика, определяется по уравнению.

где К - коэффициент диффузии данного соединения; А - площадь мембраны; (С1 - С2) - градиент концентрации по обе стороны мембраны; d - толщина мембраны.

Коэффициент диффузии яда или лекарства зависит от его молекулярной массы, степени растворимости в липидах и ионизации, а также от пространственной конфигурации молекулы.

Быстрее всего диффундируют молекулы веществ, обладающих высоким коэффициентом распределения масло/вода, т. е. липофильными свойствами. Растворимые в липидах вещества (например, многие наркотики) могут свободно с минимумом затрат проходить через клеточные мембраны по законам диффузии.

Облегченная, или катализированная диффузия. Для такой диффузии необходимо, чтобы в мембране был носитель, скорей всего, молекула белка. Транспорт происходит «под гору» и не требует затрат энергии. Носитель обратимо связывается с веществами с аналогичной химической структурой, которые могут конкурировать за зоны связывания. Ионы переносятся относительно простыми углеводородами («ионофорами»). Процесс, когда носитель переносит ионы и молекулы в обоих направлениях, называют обменной диффузией.

Активный транспорт - это система транспорта молекул или ионов с помощью носителя через мембрану против градиента концентрации или электрохимического градиента (« в гору»). В этом случае требуются затраты энергии, которая образуется в результате метаболизма АТФ в самой мембране. При таком транспорте молекула вещества соединяется с носителем, который претерпевает определенные химические превращения. В качестве носителей обычно служат ферменты. Активный транспорт играет важную роль во всасывании веществ в кишечнике и выделении химических веществ с мочой и желчью.

Пиноцитоз — особый вид активного транспорта. Небольшие капельки или частички вещества попадают в выпячивания клеточной мембраны, которые образуют маленькие вакуоли, поступающие внутрь клеток. Вещество переносится внутри клетки или переваривается в ней.