Биологическое действие излучений

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ИЗЛУЧЕНИЙ

1.     Механизмы действия излучений на уровне молекул и биологических веществ.

В механизме формирования биологического ответа на действие ионизирующих излучений на живые объекты условно можно выделить следующие этапы:

§первичные физические явления - поглощение энергии излучения атомами и молекулами биологического объекта, в результате чего они могут претерпевать возбуждение, ионизацию или диссоциацию;

§радиационно-химические процессы, при которых образуются свободные радикалы, взаимодействующие с органическими и неорганическими веществами по типу окислительно-восстановительных реакций;

§биологические реакции - обусловливают изменения функций и структур органов и систем и реакций целостного организма. Они определяют в конечном итоге механизм развития и специфику патологического процесса.

Энергия ионизирующих излучений при прохождении через биологическую ткань передается атомам и молекулам, что приводит к образованию ионов и возбужденных молекул. Это первый, физический этап формирования биологического ответа клетки на лучевое воздействие. Следующий этап называется химическим.

В основе первичных радиационно-химических изменений молекул могут лежать два механизма: 1) прямое действие, когда данная молекула испытывает изменения (ионизацию, возбуждение) непосредственно при взаимодействии с излучением; 2) косвенное действие, когда молекула непосредственно не поглощает энергию ионизирующего излучения, а получает ее путем передачи от другой молекулы, радикала или иона.

Поскольку 60 - 70 % массы биологической ткани составляет вода, рассмотрим различие между прямым и косвенным действием излучения на ее примере.

Начальные процессы радиолиза приводят к образованию радикалов Н и ОН .

Ионизированная молекула воды реагирует с другой нейтральной молекулой воды, в результате чего образуется высокореактивный радикал

гидроксила ОН .Вырванный электрон также очень быстро передает энергию окружающим молекулам воды, в результате чего возникает сильно возбужденная молекула  воды Н2О*, которая диссоциирует с образованием двух радикалов Н и ОН : Н2О+ + е Н + ОН

Свободные радикалы содержат неспаренные электроны и отличаются чрезвычайно высокой реакционной способностью. Время их жизни в воде не более 10-5с. За это время они либо рекомбинируют друг с другом, либо реагируют с субстратом.

e- + eaq-→ H2 + 2OH- 

H•+H•→H2 OH•+OH•→H2O2

В присутствии растворенного в воде кислорода образуются и другие продукты радиолиза: свободный радикал гидроперекиси НО2 , перекись водорода Н2О2, атомарный кислород и радикал кислорода О2-•, который

называется супероксидным радикалом:

Супероксидный и гидропероксидный радикалы могут наносить очень серьезные повреждения биологически важным молекулам.

При облучении водных растворов ионизирующими излучениями с малыми величинами линейной передачи энергии (ЛПЭ)*, радикалы - продукты радиолиза воды - возникают на значительных расстояниях друг от друга, в силу чего возрастает вероятность их взаимодействия с молекулами растворенных биологически важных веществ. Если излучение характеризуется высокими значениями ЛПЭ, то в плотном треке происходят радикал-радикальные взаимодействия, в силу чего снижается вероятность радиационно-химических превращений растворенных в воде веществ.

* Линейная Передача Энергии (ЛПЭ) – количество энергии, теряемой ионизирующим излучением на единицу длины пробега в веществе. За единицу ЛПЭ принимают кэВ/мкм (1 кэВ/мкм = 62 Дж/м).

В клетке организма ситуация значительно более сложная, чем при облучении воды, особенно если поглощающим веществом являются крупные и многокомпонентные биологические молекулы. В этом случае образуются органические радикалы, отличающиеся также крайне высокой реакционной способностью. Располагая большим количеством энергии, они легко могут привести к разрыву химических связей. Именно этот процесс и происходит чаще всего в промежутках между образованием ионных пар и формированием конечных химических продуктов. Кроме того, биологическое действие усиливается за счет кислородного эффекта. Образующийся в результате взаимодействия свободного радикала с кислородом также высокореакционный продукт приводит к образованию новых молекул в облучаемой системе. Получающиеся в процессе радиолиза воды свободные радикалы и окислители, обладая высокой химической активностью, вступают в химические реакции с молекулами белка, ферментов и других структурных элементов биологической ткани, что приводит к изменению биологических процессов в организме. В результате нарушаются обменные процессы, подавляется активность ферментных систем, замедляется и прекращается рост  тканей, возникают новые химические соединения, не свойственные организму, - токсины. Это приводит к нарушению жизнедеятельности отдельных систем или организма в целом.

Первым этапом радиационно-химических превращений биологических макромолекул под действием продуктов радиолиза воды является образование радикалов. Здесь можно отметить три основных типа реакций:

§отщепление атома водорода с разрывом связи -С-Н: RH + OH = R + H2O.

§разрыв двойной межуглеродной связи: R1H2C=CH2R2 + OH = R1H2C -CH2R2- OH

§отщепление присоединенной группы: NH2-CR + H = -C R + NH3. Следующим этапом являются межрадикальные реакции и реакции

радикалов с другими молекулами:

§гидроксилирование или гидрирование: R +OH (H) = ROH(H) и в дальнейшем образование карбонильных соединений RC=O.

§димеризация: R + R = R-R.

§диспропорционирование: R + R = RH + RC=CR.

§гидроперекисные превращения: R + O2 = ROO + RH = R +ROOH

альдегиды, кетоны, спирты.

Индуцированные свободными радикалами химические реакции вовлекают в этот процесс многие сотни и тысячи молекул, не затронутых излучением. В этом состоит специфика действия ионизирующего излучения на биологические объекты. Никакой другой вид энергии (тепловой, электрической и др.), поглощенной биологическим объектом в том же количестве, не приводит к таким изменениям, какие вызывают ионизирующее излучение.

Различить относительную долю прямого и косвенного излучения можно единственно с использованием так называемого эффекта разведения, который можно наблюдать при облучении растворов различных концентраций. Г. Фрикке и У.М. Дейлом в 30-40-х годах на водных растворах ферментов было установлено, что в слабых растворах действие излучения преимущественно косвенное, так как большая часть молекул растворенного вещества не участвует в реакции, протекание которой является следствием ионизации молекул растворителя. При этом число инактивированных молекул не зависит от их концентрации, так как для данной дозы в растворе образуется постоянное количество способных прореагировать водных радикалов. Иными словами, при косвенном действии независимо от разведения раствора постоянным остается абсолютное число поврежденных молекул, а изменяется их отношение к числу неповрежденных. При прямом действии число инактивированных молекул увеличивается с возрастанием концентрации раствора, а их отношение к числу неповрежденных молекул остается постоянным.

Рассмотрим лучевые реакции основных биологических макромолекул. Фосфолипиды формируют клеточные мембраны. Они могут служить мишенью, так как повреждение их даже в небольших количествах может изменить проницаемость мембран и нарушить обменные процессы в клетке. В состав фосфолипидов входят две жирные кислоты, одна из которых, как правило, насыщенная, а другая – ненасыщенная. Они составляют гидрофобный «хвост» фосфолипида. В состав гидрофильной головки входят фосфат-ион и положительно заряженная группа. Радиационно-химические превращения фосфолипидов начинаются с разрушения двойной связи в ненасыщенной жирной кислоте. В присутствии кислорода за этим следует образование гидроперекиси и распад последней с образованием различных карбонильных соединений и гидроперекисей. Еще одним превращением фосфолипидов является отщепление неорганического фосфата.

Среди нуклеиновых кислот наиболее вероятной внутриклеточной мишенью является ДНК - самая большая по размеру и наиболее биологически значимая молекула. Мономерные составляющие нуклеиновых кислот - нуклеотиды – включают в себя три компонента: азотистое основание (пурин или пиримидин), пентозу (рибозу или дезоксирибозу) и фосфат-ион. При радиолизе нуклеиновых кислот обнаружены изменения в азотистых основаниях, отмечены разрывы гликозидной связи углевод-основание и фосфоэфирной связи углевод-фосфат. Кроме того, происходят одиночные и двойные разрывы тяжей ДНК, разрывы водородных связей между комплементарными основаниями в двойной спирали, ковалентные сшивки. Двойные разрывы тяжей ДНК являются критической реакцией для репродуктивной гибели клеток.

РНК, представленную в клетке рядом форм – матричной, рибосомальной, транспортной, относят к массовым структурам клетки: они повторяются, содержась во многих копиях, и в случае необходимости могут синтезироваться в требуемом количестве. Поэтому радиационное повреждение РНК не столь ответственно за лучевое поражение клетки, как повреждение молекул ДНК. В основном типы радиационных повреждений РНК сходны с таковыми для ДНК.

Радиолиз углеводов начинается с отщепления водорода от одного из углеродных атомов с образованием углеводного радикала. После этого отщепление молекулы воды и присоединение к радикалу Н или ОН приводит к образованию карбонильного соединения.

Радиочувствительность белков во многом определяется радиочувствительностью входящих в их состав аминокислот. Ряд радиочувствительности аминокислот по мере ее снижения выглядит так: серосодержащие (цистеин, метионин); некоторые циклические (тирозин, триптофан, гистидин); имеющие в остатке азотсодержащие группы (аргинин, аспарагин, глутамин); аминокислоты, не содержащие в остатке присоединенных групп, или содержащие -ОН (фенилаланин, пролин, валин, лейцин, изолейцин, глицин, серин, треонин). Данные по радиочувствительности аминокислот нельзя безоговорочно переносить на белки - их поражаемость зависит от расположения остатков аминокислот, структуры белковой молекулы.

При действии ионизирующих излучений на белковые молекулы индуцируются изменения в аминокислотных остатках, образующих макромолекулу. Эти изменения начинаются возникновением продуктов отщепления карбоксильных групп с разрывом связи С-С, аминогрупп с

разрывом связи С-N. Существенные изменения возникают в структуре остатков серусодержащих аминокислот.

В водных средах существенную роль в радиационно-химических превращениях белковых молекул играют продукты радиолиза воды – радикал ОН и гидратированный электрон eaq . В результате первичного размена энергии в молекуле белка возникают свободнорадикальные формы, которые принимают участие в дальнейших реакциях.

Через промежуточные соединения, образующиеся по центрам локализации свободнорадикальных состояний, белки расщепляются и образуются фрагменты белковых молекул. Вместе с тем, свободные радикалы могут инициировать процессы полимеризации в разных участках белковой молекулы, образовывать амиды и карбонильные соединения; нарушения водородных связей может сопровождаться денатурацией белков. Неодинаковость радиационного повреждения различных аминокислотных остатков в молекуле белка является причиной нарушения вторичной и третичной структур белка. Кроме того, может нарушаться функционирование активных центров ферментов или же центров аллостерического взаимодействия.

С утратой свойственных неповрежденным белкам конформационных состояний связано ослабление способности белка к молекулярному узнаванию, определяющему самосборку надмолекулярных структур, таких, как мультиэнзимные комплексы, хроматин, цитоскелет, электрон-транспортная цепь митохондрий (хлоропластов).

Учитывая множественность молекул отдельных белков, возможность их синтеза de novo в случае дефицита, при умеренных облучениях прямое повреждение белковых молекул не имеет решающего значения для жизнеспособности клеток.

Основной количественной характеристикой радиационно-химических процессов является величина выхода продуктов реакции. Радиационнохимический выход измеряется числом превратившихся в ходе радиационнохимической реакции молекул на 100 эВ поглощенной энергии излучения. Суммарный выход радиационно-химических превращений воды составляет около 4. Полное описание радиационно-химических процессов в клетке представляет собой сложную задачу и обычно ограничивается упрощенным подходом, обращая внимание на значение повреждений молекул, выполняющих наиболее важные в жизнедеятельности функции.

2. Реакция клеток на облучение

Клетки организма даже в пределах одной ткани имеют различную радиочувствительность. Это зависит от стадии их развития, возраста, функционального состояния. Компоненты самой клетки также обладают различной радиочувствительностью; наибольшая чувствительность свойственна ядру.

Немедленных морфологических изменений в клетках при облучении в дозах до 1000Р не обнаруживается; в зависимости от величины дозы они появляются на 2-3 сутки. В цитоплазме после облучения происходит:

§изменение вязкости; при малых дозах она снижается, при больших - повышается;

§вакуолизация цитоплазмы (отчетливо просматривается у клеток крови, красного костного мозга, паренхиматозных органов);

§повышение проницаемости мембран для электролитов и воды - из клетки выходит калий, а в ней накапливается натрий (у эритроцитов это приводит к гемолизу);

§повышение коэффициента лучевого преломления, что, по-видимому, связано с денатурацией белков плазмы.

Одновременно могут наблюдаться и другие прижизненные изменения цитоплазмы: различные степени прижизненного окрашивания, изменения восприятия кислых и основных красителей и др.

В облученных клетках наблюдается увеличение размеров ядер. В дальнейшем изменяется форма ядра, появляются гигантские ядра, тройные звезды в митозе, трех- и четырехъядерные и гиперсегментированные клетки, некротические явления - пикноз и реже лизис ядра. Подвижные клетки после облучения обычно принимают округлую форму.

Существует группа лучевых повреждений клетки, которые она легко переносит: повреждение множественных структур клетки, нарушение метаболизма (в том числе ингибирование нуклеинового обмена, окислительного фосфорилирования и др.). Эти преходящие клеточные реакции называют физиологическими или кумулятивными эффектами облучения. Они проявляются в ближайшее после облучения время и вскоре исчезают.

Универсальным примером преходящих лучевых реакций клеток является радиационная блокировка митозов. Еще на заре становления радиобиологии было замечено, что количество делящихся клеток в популяции после облучения резко снижается. Отсюда возникла идея лучевого подавления развития опухолей. В настоящее время доказано, что время задержки митозов строго зависит от дозы облучения и этот эффект проявляется у всех клеток, независимо, выживут они после облучения или погибнут. В опытах на синхронизированных культурах клеток было получено, что задержка деления составляет примерно 1 час на 1Гр, причем с увеличением дозы облучения возрастает не доля реагирующих клеток, а величина реакции (продолжительность задержки деления) каждой облученной клетки. Наиболее выражена задержка деления при облучении клеток в синтетической и постсинтетической фазах клеточного цикла. Из-за различий времени задержки митозов восстановление митотической активности пула происходит волнообразно, т.к. любая делящаяся ткань представляет собой асинхронную клеточную популяцию. Динамика митотической активности клеток после облучения зависит от дозы и вида облучения. Вскоре после первичного падения, митотический индекс резко повышается, а затем снова снижается. Это начальное повышение - не истинное увеличение числа митозов, не возврат к

норме, а одновременный митоз сильно- и слабозаторможенных клеток. Так образуется компенсаторная волна деления. Радиационная блокировка митозов является защитной реакцией клеток на облучение. Задержку митозов следует отличать от полного подавления митозов, когда клетка сохраняет жизнеспособность, но утрачивает способность делиться.

Летальные реакции клеток. В радиобиологии под клеточной гибелью понимают утрату клеткой способности к пролиферации, а выжившими называют клетки, которые после облучения сохранили способность к неограниченному делению (клонообразованию).

Типы (формы) клеточной гибели:

1.Интерфазная (интеркинетическая) гибель: § до деления (под лучом); § без деления.

2.Митотическая (репродуктивная) гибель: § после первого деления; § в последующих делениях;

§ гибель делящихся клеток популяции.

Чем выше доза облучения, тем раньше гибнут клетки. Одной из форм клеточной гибели является слияние двух клеток и образование гигантской клетки. Такие клетки способны к 2-3 делениям до гибели (они нежизнеспособны).

Основной причиной репродуктивной гибели клеток является повреждение ДНК. Типы лучевых повреждений ДНК:

§ одиночные и двойные разрывы (именно они ответственны за летальный исход облучения);

§ повреждение азотистых оснований нуклеотидов с последующим их удалением из ДНК;

§ внутри- и межмолекулярные сшивки типа ДНК-ДНК, ДНК-белок; Экспериментальные доказательства определяющей роли ядра в клеточной

радиочувствительности представлены в блестящих исследованиях Б.Л. Астаурова, использовавшего для этой цели феномен андрогенеза (мужского

партеногенеза) - возможности развития организма из мужской зародышевой клетки без процесса оплодотворения.

Б.Л. Астауровым было продемонстрировано получение потомства тутового шелкопряда, состоящего только из самцов, по всем признакам повторяющих отца, путем предварительного облучения готовой к оплодотворению и кладке яиц самки бабочки при дозе 500 Гр (доза, смертельная для самки и ядерного аппарата еще не отложенных яиц). Однако гибель такой обреченной бабочки происходит не сразу, и она могла копулировать с необлученным самцом и отложить яйца. Отложенные после копуляции яйца подвергали тепловому воздействию для побуждения партеногенетического развития. Из таких яиц выходили гусеницы, маркированные только признаками отца, а после окукливания вылуплялись только самцы, которые повторяли признаки отца. Схема опыта приведена на

Причина получения такого андрогенетического потомства состоит в следующем: у тутового шелкопряда в каждую яйцеклетку проникает несколько сперматозоидов, но с женским пронуклеусом сливается ядро лишь одного из них. Так как женский пронуклеус в яйцеклетке был разрушен в результате

облучения, то его место заняло ядро одного из проникших в такое облученное ядро сперматозоидов, а ядро сперматозоида приняло на себя роль второго ядерного оплодотворяющего комплекса, что привело к образованию нормального диплоидного ядра, у которого, однако, оба набора хромосом получены от отца. Наиболее важно то, что огромный по сравнению с ядром объем материнской плазмы, также подвергшийся облучению, никак не сказался на жизнеспособности потомства.

Еще одним примером экспериментов, доказывающих несравненно большую радиочувствительность ядра являются опыты И. Орда и К. Даниелли. В опытах на амебах с помощью микрохирургического метода они показали, что пересадка ядер от особей, облученных при дозе 150 Гр, при которой выживает 5% клеток, вызывала примерно такой же летальный эффект (выживало 4% реципиентов). Если же облучению подвергали цитоплазму даже в дозе 250 Гр, после чего в нее трансплантировали необлученное ядро, то эффекта вообще не наблюдалось; все 100% амеб делились и давали жизнеспособное потомство.

Приведенные примеры демонстрируют несравненно большую радиочувствительность ядра по сравнению с цитоплазмой, однако они не отвергают роль последней в радиационном поражении ядерного аппарата. Имеется достаточно большое количество экспериментальных данных об усилении ядерных нарушений и о зависимости их проявления от степени облучения цитоплазмы, что является следствием сложных ядерноцитоплазматических отношений.