Иммунодиагностика

Общий иммунологический анализа крови включает:

1) подсчет общего числа лейкоцитов;

2) выведение лейкограммы и расчет абсолютного количества лимфоцитов;

3) определение относительного и абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов;

4) определение фагоцитарной активности нейтрофилов;

5) определение концентрации в сыворотке крови суммарного количества иммуноглобулинов и их основных классов.

Эти тесты позволяют выявить обобщенные характеристики или "грубые" дефекты в клеточном и гуморальном иммунитете, в системе фагоцитоза.

Общий иммунный анализ крови у животных

Подсчет количества лейкоцитов производится в камере с сеткой Горяева. Относительное количество видов лейкоцитов определяется посредством микроскопии мазков крови, которые изготавливаются, фиксируются и окрашиваются по общепринятой схеме. Дифференциация лейкоцитов проводится по морфологическим признакам, результат заносится в таблицу Егорова или фиксируется на клавишном счетчике.

Лейкограмма дает представление об относительном (в процентах) содержании различных видов лейкоцитов в крови, в т.ч. и лимфоцитов. Полученное процентное содержание лимфоцитов характеризуется как их относительная величина в популяции лейкоцитов крови. Зная общее количество лейкоцитов и относительное содержание лимфоцитов, вычисляется абсолютное число видов лейкоцитов, в т.ч. и лимфоцитов.

Определение относительного и абсолютного количества Т- и В- лимфоцитов крови. Т- и В-популяции лимфоцитов мало различимы при световой микроскопии. Вместе с тем эти клетки имеют отчетливые антигенные и функциональные различия. Т-лимфоциты обеспечивают клеточные реакции иммунитета, в частности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и реакции трансплантационного иммунитета. В-лимфоциты преимущественно отвечают за гуморальное звено иммунитета, они являются предшественниками антителпродуцирующих клеток.

Одним из методов определения числа Т- и В-лимфоцитов в крови является реакция розеткообразования. Суть феномена состоит в том, что при контакте Т-лимфоцитов с эритроцитами барана клетки формируют образования, напоминающие тутовую ягоду, которые принято называть розетками. В-лимфоциты также могут формировать розетки, но для этого нужны более сложные условия: эритроциты нагружаются комплексом аниген- антитело-комплемент.

Методика определения количества Т- и В-лимфоцитов включает следующие этапы:

- выделение лимфоцитов из периферической крови (отделение плазмы крови с лейкоцитами от эритроцитов, выделение лимфоцитов из крови на градиентах плотности центрифугированием, определение количества и жизнеспособности лимфоцитов);

- определение количества Т-лимфоцитов (приготовление эритроцитов барана, смешивание взвеси лимфоцитов и суспензии эритроцитов, приготовление, фиксация и окрашивание мазков, идентификация Т-лимфоцитов по образованию розеток (Е-РОК), расчет относительного и абсолютного количества клеток);

- определение количества В-лимфоцитов (приготовление эритроцитов барана, нагруженных комплексом анитело + комплемент, смешивание и инкубирование взвеси лимфоцитов и суспензии эритроцитов, приготовление, фиксация и окрашивание мазков, идентификация клеток по выявлению рецепторов к третьему компоненту комплемента (ЕАС-РОК), расчет количества В-лимфоцитов).

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов (фагоцитарное число, фагоцитарный индекс).

Фагоцитарная активность лейкоцитов максимально выражена у нейтрофилов и, в меньшей мере, у моноцитов и зозинофилов. Фагоцитарная активность лейкоцитов зависит не только от функциональной активности клеточных элементов, но и от состояния внутренней среды организма. Интенсивность же фагоцитоза в значительной степени обусловлена активностью самих клеточных элементов.

Наибольшее распространение получила методика определения фагоцитарной активности клеток крови по Кост и Стенко. Принцип методики основан на том, что при контакте с чужеродными частицами гранулоциты и моноциты поглощают (фагоцитируют) и разрушают их внутриклеточными ферментами. Рассчитывают фагоцитарная активность, фагоцитарное число и фагоцитарный индекс (ФИ) нейтрофилов.

Определение иммуноглобулинов в сыворотке крови.

В ветеринарной лабораторной практике существует несколько методов определения иммуноглобулинов.

1. Количественное определение иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии в геле, содержащем моноспецифичную иммунную сыворотку (по Манчини). Суть методики: на стекляные пластины разливают раствор агара, содержащий моноспецифичную сыворотку, после застывания, в агаре делают лунки, в которые вносят исследуемую сыворотку крови животных. Затем пластины помещают во влажную камеру при 37^оС и инкубируют в течение определенного времени. Далее замеряют диаметр образовавшихся колец преципитатов. В качестве стандарта используется сыворотка с известным количеством определенного иммуноглобулина.

2. Определение иммуноглобулинов методом дифференциального электрофореза в полиакриламидном геле (в модификации В.М.Холода, 1983). Принцип метода: разделяют белки в зависимости от заряда белковой мицеллы и размера молекулы.

3. Определение иммуноглобулинов в сыворотке крови путем осаждения цинком сульфатом или натрия сульфитом. Принцип метода основан на том, что при добавлении цинка сульфата или натрия сульфита происходит осаждение из сыворотки иммуноглобулинов. Образующееся при этом помутнение, интенсивность которого зависит от концентрации иммуноглобулинов, можно оценить с помощью колориметра или нефелометра. Методы эти простые, но недостаточно специфичные.

При некоторых патологических расстройствах наблюдаются значительные отклонения уровней иммуноглобулинов в крови. Концентрация Ig G возрастает во время инфекционных заболеваний, при некоторых болезнях печени и аутоиммунных растройствах. Уровень этих иммуноглобулинов снижается при гипо- и агаммаглобулинемиях, задержке развития и некоторых опухолях лимфоидной системы.

Концентрация Ig M повышается при инфекционных заболеваниях, поражающих систему крови, при острых гепатитах и первичном билиарном циррозе. Снижается - при гипо- и агаммаглобулинемиях, некоторых опухолях лимфоидной системы.

Уровень сывороточного Ig A возрастает при заболеваниях дыхательных путей и кишечного тракта, при перитониальных инфекциях. Снижается - при гипо- и агаммаглобулинемиях, некоторых опухолях лимфоидной системы.

Определение основных популяций (Т-клетки, В-клетки, натуральные киллеры) и субпопуляций Т-лимфоцитов (Т-хелперы, Т-ЦТЛ).

Для первичного исследования иммунного статуса и выявления выраженных нарушений иммунной системы  рекомендовано определение CD3, CD4, CD8, CD19, CD16+56, соотношение CD4/CD8. Исследование позволяет определить относительное и абсолютное количество основных популяций лимфоцитов: Т-клетки – CD3, В-клетки – CD19, натуральные киллеры (NK) – CD3- CD16++56+, субпопуляции Т лимфоцитов (Т-хелперы CD3+ CD4+, Т-цитотоксические CD3+ CD8+ и их соотношение).

Метод исследования

Иммунофенотипирование лимфоцитов проводится c использованием моноклональных антител к поверхностным дифференцировочным ангинам на клетках иммунной системы, методом проточной лазерной цитофлуорометрии на проточных цитофлуориметрах.

Выбор зоны анализа лимфоцитов производится по дополнительному маркеру CD45, который представлен на поверхности всех лейкоцитов.

Условия взятия и хранения образцов

Венозная кровь, взятая из  вены, утром, строго натощак, в вакуумную систему до указанной на пробирке метки. В качестве антикоагулянта используется К2ЭДТА. После взятия пробирку с образцом медленно переворачивают 8-10 раз для перемешивония крови с антикоагулянтом. Хранение и транспортировка строго при 18–23°С в вертикальном положении не более 24 ч.

Невыполнение этих условий приводит к некорректным результатам.

Интерпретация результатов

Т-лимфоциты (CD3+ клетки). Повышенное количество свидетельствует о гиперактивности иммунитета, наблюдается при острых и хронических лимфолейкозах. Увеличение относительного показателя встречается при некоторых вирусных и бактериальных инфекциях в начале заболевания, обострениях хронических заболеваний.

Снижение абсолютного количества Т-лимфоцитов свидетельствует о недостаточности клеточного иммунитета, а именно о недостаточности клеточно-эффекторного звена иммунитета. Выявляется при воспалениях разнообразной этиологии, злокачественных новообразованиях, после травмы, операций. Повышение их числа в динамике заболевания – клинически благоприятный признак.

В-лимфоциты (CD19+ клетки) Снижение наблюдается при физиологических и врожденных гипогаммаглобулинемиях и агаммаглобулинемиях, при новообразованиях иммунной системы, острой вирусной и хронической бактериальной инфекциях, состоянии после удаления селезенки.

Увеличение отмечается при аутоиммунных заболеваниях, хронических заболеваниях печени, циррозе, муковисцедозе, бронхиальной астме, паразитарных и грибковых инфекциях. Характерно в период реконвалесценции после перенесенных острых и хронических вирусных и бактериальных инфекций. Выраженное увеличение наблюдается при хроническом В-лимфолейкозе.

NK-лимфоциты с фенотипом CD3-CD16++56+ Натуральные киллеры (NK-клетки) – популяция больших гранулярных лимфоцитов. Они способны лизировать клетки-мишени, инфицированные вирусами и другими внутриклеточными антигенами, опухолевые клетки, а также другие клетки аллогенного и ксеногенного происхождения.

Увеличение количества NK-клеток связано с активацией антитрансплантационного иммунитета, в некоторых случаях отмечается при бронхиальной астме, встречается при вирусных заболеваниях, повышается при злокачественных новообразованиях и лейкозах, в периоде реконвалесценции.

Снижение наблюдается при врожденных иммунодефицитах, паразитарных инфекциях, аутоиммунных заболеваниях, облучении, лечении цитостатиками и кортикостероидами, стрессе, дефиците цинка.

Т-лимфоциты хелперы с фенотипом CD3+CD4+ Увеличение абсолютного и относительного количества наблюдается при аутоиммунных заболеваниях, может быть при аллергических реакциях, некоторых инфекционных заболеваниях. Это увеличение свидетельствует о стимуляции иммунной системы на антиген и служит подтверждением гиперреактивных синдромов.

Снижение абсолютного и относительного количества Т-клеток свидетельствует о гипореактивном синдроме с нарушением регуляторного звена иммунитета, является; встречается при хронических заболеваниях (бронхитах, пневмониях и т.д.), солидных опухолях.

Т-цитотоксические лимфоциты с фенотипом CD3+ CD8+ Повышение выявляется практически при всех хронических инфекциях, вирусных, бактериальных, протозойных инфекциях. Является характерным для ВИЧ-инфекции. Снижение наблюдается при вирусных гепатитах, герпесе, аутоиммунных заболеваниях.

Соотношение CD4+/CD8+ Исследование соотношения CD4+/CD8+ (CD3, CD4, CD8, CD4/CD8) рекомендовано только для мониторинга ВИЧ-инфекции и контроля эффективности АРВ терапии. Позволяет определить абсолютное и относительное количество Т-лимфоцитов, субпопуляций Т-хелперов, ЦТЛ и их соотношение.

Диапазон значений – 1,2–2,6. Снижение наблюдается при врожденных иммунодефицитах (синдром Ди-Джоржи, Незелофа, Вискотта-Олдрича), при вирусных и бактериальных инфекциях, хронических процессах, воздействии радиации и токсических химических веществ, множественной миеломе, стрессе, снижается с возрастом, при эндокринных заболеваниях, солидных опухолях. Является патогномичным признаком для ВИЧ-инфекции (менее 0,7).

Увеличение значения более 3 – при аутоиммунных заболеваниях, остром Т-лимфобластном лейкозе, тимоме, хроническом Т-лейкозе.

Изменение соотношения может быть связано с количеством хелперов и ЦТЛ у данного пациента. Например, снижение количества CD4+ Т-клеток при острой пневмонии в начале заболевания ведет к снижению индекса, а ЦТЛ при этом могут не измениться.

Для дополнительного исследования и выявления изменений иммунной системы при патологиях требующих оценки наличия острого или хронического воспалительного процесса и степени его активности, рекомендуется включать подсчет количества активированных Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+HLA-DR+ и ТNK–клеток с фенотипом CD3+CD16++56+.

Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+HLA-DR+ Маркер поздней активации, показатель гиперреактивности иммунитета. По экспрессии данного маркера можно судить о выраженности и силе иммунного ответа. Появляется на Т-лимфоцитах после 3-го дня острого заболевания. При благоприятном течении заболевания снижается до нормы. Увеличение экспрессии на Т-лимфоцитах может быть при многих заболеваниях, связанных с хроническим воспалением. Отмечено его повышение у пациентов с гепатитом С, пневмониями, ВИЧ-инфекцией, солидными опухолями, аутоиммунными заболеваниями.

ТNK-лимфоциты с фенотипом CD3+CD16++CD56+ Т-лимфоциты, несущие на своей поверхности маркеры CD16++ CD 56+. Эти клетки имеют свойства как Т-, так и NK-клеток. Исследование рекомендовано как дополнительный маркер при острых и хронических заболеваниях.

Снижение их в периферической крови может наблюдаться при различных органоспецифических заболеваниях и системных аутоиммунных процессах. Увеличение отмечено при воспалительных заболеваниях разной этиологии, опухолевых процессах.

Исследование ранних и поздних маркеров активации Т-лимфоцитов (CD3+CD25+, CD3-CD56+, CD95, CD8+CD38+) дополнительно назначают для оценки изменений ИС при острых и хронических заболеваниях, для диагностики, прогноза, мониторинга течения заболевания и проводимой терапии.

Т-активированные лимфоциты с фенотипом CD3+CD25+, рецeптор к ИЛ2 CD25+ – маркер ранней активации. О функциональном состоянии Т-лимфоцитов (CD3+) свидетельствует количество экспрессирующих рецепторов к ИЛ2 (CD25+). При гиперактивных синдромах количество этих клеток возрастает (острые и хронические лимфолейкозы, тимома, отторжение трансплантата), кроме того, повышение их может свидетельствовать о ранней стадии воспалительного процесса. В периферической крови их можно выявить в первые три дня болезни. Снижение числа этих клеток может наблюдаться при врожденных иммунодефицитах, аутоиммунных процессах, ВИЧ-инфекции, грибковых и бактериальных инфекциях, ионизирующей радиации, старении, отравлении тяжелыми металлами.

Т-цитотоксические лимфоциты с фенотипом CD8+CD38+ Присутствие CD38+ на ЦТЛ лимфоцитах отмечено у пациентов с разными заболеваниями. Информативный показатель при ВИЧ-инфекции, ожоговой болезни. Увеличение числа ЦТЛ с фенотипом CD8+CD38+ наблюдается при хронических воспалительных процессах, онкологических и некоторых эндокринных заболеваниях. При проведении терапии показатель снижается.

Субпопуляция натуральных киллеров с фенотипом CD3- CD56+ Молекула CD56 – адгезивная молекула, широко представленная в нервной ткани. Кроме натуральных киллеров, экспрессируется на многих типах клеток, в том число на Т-лимфоцитах.

Увеличение данного показателя свидетельствуют о расширении активности специфического клона клеток киллеров, которые имеют меньшую цитолитическую активность, чем NK-клетки с фенотипом CD3- CD16+. Количество этой популяции возрастает при гематологических опухолях (ЕК-клеточная или Т-клеточная лимфома, плазмоклеточная миелома, апластическая крупноклеточная лимфома), хронических заболеваниях, некоторых вырусных инфекциях.

Снижение отмечается при первичных иммунодефицитах, вирусных инфекциях, системных хронических заболеваниях, стрессе, лечении цитостатиками и кортикостероидами.

Рецептор CD95+ – один из рецепторов апоптоза. Апоптоз – сложный биологический процесс, необходимый для удаления из организма поврежденных, старых и инфицированных клеток. Рецептор CD95 экспрессируется на всех клетках иммунной системы. Он играет важную роль в контроле функционирования иммунной системы, так как является одним из рецепторов апоптоза. Его экспрессия на клетках определяет готовность клеток к апоптозу.

Снижение доли CD95+-лимфоцитов в крови пациентов свидетельствует о нарушении эффективности последнего этапа выбраковки дефектных и инфицированных собственных клеток, что может привести к рецидиву заболевания, хронизации патологического процесса, развитию аутоиммунных заболеваний и повышению вероятности опухолевой трансформации (к примеру, рака шейки матки при папилломотозной инфекции). Определение экспрессии CD95 имеет прогностическое значение при миело- и лимфопролифератиных заболеваниях.

Повышение интенсивности апоптоза наблюдается при вирусных заболеваниях, септических состояниях, при употреблении наркотических средств.

Активированные лимфоциты CD3+CDHLA-DR+, CD8+CD38+, CD3+CD25+, CD95. Тест отражает функциональное состояние Т-лимфоцитов и рекомендован для контроля за течением заболевания и контроля иммунотерапии при воспалительных заболеваниях разной этиологии.