Лекция 4. ТЕХНОЛОГИЯ БЕЛКОВЫХ ПРОДУКТОВ ИЗ ВОДНЫХ БИОРЕСУРСОВ

Роль белков в питании человека.

Потребность в белке эволюционно сложившаяся доминанта в питании человека, обусловленная необходимостью обеспечивать минимальный физиологический уровень поступления незаменимых аминокислот, используемых организмом для синтетических процессов. Она зависит от состояния азотистого баланса и биологической ценности поступающего с питанием белка. При положительном азотистом балансе в периоды роста и развития организма, а также при интенсивных репаративных процессах потребность белка на единицу массы тела будет выше, чем у взрослого здорового человека. Минимальным физиологическим количеством надежным уровнем поступления белка считается 0,6 г полноценного протеина на 1 кг массы тела в сутки.

Уровень надежной потребности установлен экспериментально и относится к стандартному белку, утилизирующемуся в организме на 100 %. К этой цифре приближаются белки молока, яиц, рыбы и мяса. В рационе человека, как правило, представлен смешанный (животный и растительный) белок. Утилизация его из суточного рациона не превышает в развитых странах 75 %. Оптимальная потребность в таком белке составляет 0,8 1,2 г на 1 кг массы тела в сутки. Оптимальным уровнем поступления белка следует считать 30 г смешанного протеина (при наличии не менее 55 % животного белка) на 1000 ккал рациона. Уровень реальной потребности в смешанном пищевом белке количество протеина, обеспечивающее азотистый баланс и дополнительные (в том числе и адаптационные) потребности организма в незаменимых аминокислотах, напрямую зависит от энергозатрат (в среднем 12 % калорийности рациона должны составлять белковые калории), качества протеина пищи (чем выше его биологическая ценность, тем меньшим количеством будут удовлетворяться физиологические потребности организма) и условий среды обитания.

Уровень реальной потребности в белке человека с энергозатратами 2 800 ккал должен обеспечиваться:

1) ежедневным потреблением: 500 г молока и жидких молочных продуктов; 170 г мяса и мясопродуктов (включая птицу, субпродукты); люда, имеющие сбалансированный аминокислотный состав. 360 г хлеба и хлебобулочных изделий;

2) еженедельным потреблением: 140 г сыра; 200 г творога; 350 г рыбы и морепродуктов; 200 г яиц; 175 г круп; 140 г макаронных изделий.

Оценку адекватности обеспечения реальной потребности в белке у взрослого человека необходимо проводить с использованием индикаторных параметров пищевого статуса: индекса массы тела и соотношения в крови различных белковых фракций (альбумин-глобулиновый индекс). Качество белка определяется его аминокислотным составом и отражается в понятии «биологическая ценность».

Биологическая ценность протеина – это степень утилизации белкового азота организмом. Чем выше этот показатель, тем выше качество белка.

Поиск новых и нетрадиционных источников продовольственного сырья связан главным образом с экологически обусловленной невозможностью обеспечить население планеты необходимым объемом традиционных продуктов питания. В этой связи основной проблемой является дефицит полноценного протеина, а вопрос получения и рационального использования этого незаменимого и в то же время трудновоспроизводимого и дорогостоящего пищевого вещества относится к числу наиболее важных стратегических задач развития человеческого общества.

Решение задачи по увеличению производства пищевого белка связана, во-первых, с интенсификацией традиционных способов его получения, во-вторых, с более широким использованием в питании человека нетрадиционных и новых белковых ресурсов. В ближайшие десятилетия главным путем увеличения белковых ресурсов, по-видимому, останется традиционный, связанный с повышением продуктивности сельскохозяйственного производства (в том числе за счет селекции и биотехнологических приемов, основанных на генно-инженерных методах) и снижением потерь при переработке и обороте продовольственного сырья и пищевых продуктов.

Под нетрадиционными и новыми источниками белка, перспективными для использования в питании, подразумевают протеинсодержащие продукты, являющиеся или отходами пищевого и кормового производства и малоутилизируемым пищевым сырьем, или совершенно новые ресурсы для получения белка. К нетрадиционным источникам белка относятся: - вторичные белоксодержащие продукты: обрат, молочная сыворотка, казеинаты, кровь и органы убойных животных, продукты переработки бобовых (соевые белковые продукты); - отходы и побочные продукты пищевого и кормового производства: бобовые культуры, отходы мельничных производств, шрот из семян подсолнечника, льна, хлопчатника, арахиса, сои, сафлора и некоторых других масличных культур, кукурузных зародышей, томатов, винограда; малоутилизируемое и не используемое ранее пищевое сырье некоторые виды рыб и морепродуктов, биомасса зеленых растений, шрот из семян рапса и других крестоцветных, некоторые ткани и органы убойных животных. Одноклеточные и многоклеточные водоросли, мицелий грибов, дрожжи, а также белки и аминокислоты микробиологического и химического синтеза являются новыми источниками белка.

Возможность использования для целей питания новых белковых ресурсов зависит от разработки двух взаимосвязанных проблем: технологической и медицинской. Первая определяется кругом вопросов, касающихся изыскания белоксодержащих источников, обоснования методов изолирования и концентрирования белка, разработки приемов рационального его использования в пищевом производстве.

Вторая проблема связана с необходимостью анализа химического состава, изучением безопасности, определением пищевой и биологической ценности и обоснованием оптимальных путей применения новых белковых продуктов в питании. Наиболее сложный вопрос, по-видимому, заключается в поиске разумного баланса между технологической рациональностью и гигиенической оптимальностью использования нового белка.

Наиболее целесообразным конечным продуктом переработки протеинсодержащего сырья являются: изоляты белка (не менее 90 % протеина), получаемые выделением и растворением белка с последующим осаждением его в изоэлектрической точке; концентраты белка (не менее 65 % протеина), получаемые очисткой соответствующего сырья от небелковых продуктов. Данные формы не только наиболее удобны для пищевых производств, но и содержат наименьшие количества токсичных и антиалиментарных веществ, удаляемых при технологической переработке исходного сырья. Могут также использоваться белоксодержащие продукты с широким диапазоном содержания белка, такие как текстурат, гидролизат, мука. Все потенциальные источники белка должны рассматриваться в качестве носителей как известных, так и новых токсических, аллергенных и антиалиментарных веществ.

Кроме того, при выделении белков из этих источников могут применяться физические методы, химические вещества или технологические режимы, снижающие их биологическую ценность или контаминирующие их чужеродными соединениями. В наиболее изученном и широко применяемом белоксодержащем сырье белковых продуктах переработки сои (муке, изоляте, концентрате, текстурате) содержится ряд биологически активных веществ и антиалиментарных факторов. Некоторые из них разрушаются при тепловой обработке (гемагглютенины, гой-трогены, ингибиторы трипсина), другие достаточно устойчивы (аллергены, эстрогенстимулирующие изофлавоны, неперевариваемые олигосахара (рафиноза, стахиоза, вербаскоза), их концентрация снижается прямо пропорционально очистке белкового продукта (наименьшее количество остается в изоляте). Все это требует максимального внимания к технологии производства соевых белковых продуктов и оценке их качества.

Микробиологический синтез.

Быстрое получение белка из дешевого сырья сделало приоритетным технологии микробиологического синтеза. В одном аппарате на заводе ежесуточно производится около 15 т, а за год 45 тыс. т перевариваемого белка. Такое количество белка содержится в урожае гороха с площади 18 тыс. га. Основной вид сырья для выработки микробного белка жидкие парафины, выделяемые из нефти. Тонны сырья достаточно для получения 600 кг кормового белка, содержащего 60 % белка, а также ценные витамины.

Как кормовой белок обычно применяют высушенные дрожжевые клетки. Их добавляют в комбикорма в количестве 5 - 10 % общей массы для корма свиней, телят, кур-несушек. Прибавка в корм тонны дрожжей способна обеспечить дополнительное производство около 0,5 т свинины или 1,5 т мяса птицы, около 30 тыс. штук яиц. При этом экономится 57 т зерна.

Для производства микробного белкового концентрата как сырье можно использовать природный газ, метанол, отходы растениеводства. Разработаны микробиологические технологии производства кормового белка из соломы зерновых культур, стеблей подсолнечника, льна и конопли, обрезков виноградной лозы. Скармливая растительный и микробный белок животным, удается получить только 20 30 % белка в мясе. Вот почему гораздо экономичнее было бы производить и потреблять пищевой белок микробиологического синтеза. Может возникнуть вопрос, что хорошего в колбасе из нефти, даже если получают белок не из нефти, а из ее высокоочищенной фракции. В самом деле, мы привыкли питаться белками мяса, молока и пшеницы.

И все же, применяя различные добавки к микробному белку, можно добиться вкуса и запаха традиционных пищевых белков. К наиболее важным продуктами микробного синтеза относятся: аминокислоты, нуклеозидфосфаты, витамины, провитамины, коферменты, ферменты, антибиотики, гиббереллины, белково-витаминные препараты.

Аминокислоты. Существенное преимущество микробиологического синтеза. аминокислот возможность их получения в виде природных изомеров (L-форм). Продуцентами аминокислот служат, главным образом, мутанты, лишенные ряда ферментных систем, благодаря чему происходит сверхсинтез необходимого продукта. Обычно используют бактерии, относящиеся к роду Brevibacterium.

Наибольший удельный вес среди аминокислот, вырабатываемых мировой промышленостью, занимают лизин и глутаминовая кислота. Получены мутанты микроорганизмов, способные к сверхсинтезу всех кодируемых аминокислот. Заменимые синтезируются in vivo из аммиака и различных источников углерода. Микроорганизмы сами синтезируют все необходимые им аминокислоты из аммиака и нитратов, а углеродные «скелеты» из соответствующих интермедиаторов. Исходя из оценки аминокислот, ученые давно стремятся использовать способности микроорганизмов продуцировать заменимые и незаменимые аминокислоты в ощутимых количествах. Потребность людей в аминокислотах достаточно велика и этим определяется уровень их производства в мире (порядка 500 тыс. тонн в год).

К числу продуктов микробиологического синтеза относятся также некоторые средства защиты растений, например, бактериальные энтомопатогенные препараты, вызывающие гибель вредных насекомых и предотвращающие их массовое размножение, и многие бактериальные удобрения.

Большинство микроорганизмов и зеленые растения способны синтезировать de novo все двадцать аминокислот. Углеродные скелеты аминокислот образуются из промежуточных продуктов обмена. Промышленное производство аминокислот осуществляется двумя способами: микробиологическим и химическим.

Оба способа обеспечивают получение природных аминокислот необходимой степени химической и оптической чистоты. Так что, в конечном счете, когда речь идет о промышленном производстве, последнее слово остается за экономикой: по данным зарубежных специалистов, при больших масштабах химические методы становятся более рентабельными. Микробиологический синтез основан на выращивании определенных видов микроорганизмов на питательных средах, имеющих подходящий источник углерода (чаще всего это сахара, содержащиеся, например, в патоке). Мутированные микроорганизмы с нарушенным азотным обменом выделяют в раствор большое количество какой-либо одной аминокислоты. После окончания процесса ферментации аминокислоту выделяют из раствора химическими методами. Путем микробиологической ферментации получают основное количество глутаминовой кислоты и весь лизин. У этого процесса свои преимущества и свои недостатки. С одной стороны, в нем мало стадий и требуется относительно простая и универсальная аппаратура. С другой стороны, живые микроорганизмы, с которыми приходится работать, очень чувствительны к малейшему изменению условий, а концентрация целевого продукта получается низкой, что ведет к увеличению размеров аппаратуры. Специфические ферменты, регулирующие биосинтез аминокислот, широко распространены у бактерий; они с определенной глубиной изучены у Escherichia coli. Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis и прочие.

У грибов, на аминокислотное лимитирование, отмечается некоординированное, параллельное возрастания уровня ферментов, катализирующих реакции биосинтеза различных аминокислот. Этот «общий контроль биосинтеза аминокислот» был также назван «метаболическим интерблоком», или «перекрестнопутевой регуляцией», впервые выявленной у Neurospora crassa в 1965 г. М. Карсиотисом и сотрудниками, а позднее у Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulas и других грибов. В гиперпродукции отдельных аминокислот культурами Escherichia coli, Serratia marcescens и другие важную роль играют Feedback репрессия, например, при биосинтезе ароматических аминокислот на последних стадиях. Природные аминокислоты являются, как правило, оптически активными L- и Dформами, которые трудно разделить. Вот почему микробный синтез с помощью коринебактерий и некоторых других микробов является ныне основным и экономически выгодным. Первое место здесь по праву занимает Япония, где лишь глутаминовой кислоты

Химический синтез. Химический синтез более универсален, чем микробиологический, и позволяет получать соединения любой возможной структуры. Здесь используется непищевое минеральное сырье, достигается любая концентрация продукта, однако, как правило, процесс многостадиен и требует более сложной аппаратуры.

Изготавливается свыше 100 тысяч тонн в год; большинство природных незаменимых аминокислот производит фирма «Такеда». Получены микробы суперпродуценты из родов Brevibacterium, Corynebacterium, Micrococcus и другие, с помощью которых освоено крупнотоннажное производство не только глутамата, но и L-лизина, L-валина, L-гистидина и других. Существует способ микробиологического получения фенилаланина при помощи тирозин- и метиониндефицитного мутанта Brevibacterium lactofermentum. В периодическом процессе ферментации достигнута концентрация продукта 24,8 г/л. Однако для данного процесса требуются сложные и дорогие среды. Определенный интерес представляют биосинтез фенилаланина ауксотрофным мутантом Е. coli, который можно культивировать в глюкозной среде с фосфатами. Процесс ферментации осуществляют доливным методом с рециркуляцией биомассы. Биомасса в реакторе 60-м часу достигает 45 - 50 г/л, а концентрация фенилаланина 22,4 - 22,8 г/л. Продуктивность системы 0,72 -0,86 г/л (ч ); выход продукта 0,11 г.

В настоящее время имеются продуценты, у которых количество синтезируемого специфического белка достигает 10 15 % (здесь важнейшую роль играют многокопийные плазмиды, несущее встроенный гены). Генно-инженерными методами во ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (г. Москва) был получен штамм Escherichia coli, обладающий сверхпродукцией L-треонина (30 г/л за 40 часов ферментации). Получен штамм Escherichia coli, продуцирующий за 48 часов 27 г/ L-пролина, и штамм, продуцирующий до 22,4 г/л L фениланина. С помощью Corynebacterium sp. можно получить на алкалосодержащих средах L-тирозин (до 19 г/л); с помощью Corynebacterium glutamicum на глюкозной среде L-валин (до 11 г/л; L-аргинин, L-гистидин, L-изолейцин 15 20,8 г/л). С любым штаммом, продуцентом какой-либо аминокислоты, необходимо внимательное и бережное обращение в целях поддерживания ее в активном состоянии в течение длительного времени.

Получение аминокислот с помощью иммобилизованных ферментов и клеток. Экономически целесообразным являются способы получения аминокислот с помощью иммобилизованных ферментов и клеток. Сравнительно давно реализован процесс получения L-аспаргиновой кислоты из фумаровой и аммиака в одну стадию с помощью иммобилизованных клеток Е. coli или Pseudomonas aeruginosa. Нуклеозидфосфаты. Развитие микробиологического синтеза нуклеотидов (инозиновой, гуаниловой и других кислот) связано с перспективами получения искусственной пищи, где их используют в качестве вкусовых добавок. При введении в состав среды для культивирования микроорганизмов метаболических предшественников продуктов синтеза можно получать практически все известные нуклеозидфосфаты, в том числе АТФ. Накопление нуклеозидфосфатов происходит преимущественно вне клеток микроорганизмов.

Витамины, провитамины, коферменты. Методом микробиологического синтеза. производят в основном витамин В12 и его коферментную форму. Продуцентами в этом процессе служат пропионовокислые бактерии. Для получения кормовых концентратов, содержащих витамин В12, на отходах бродильной промышленности (послеспиртовые, ацетоно-бутиловые барды и др.) применяют комплекс метанообразующих бактерий. Разработаны способы получения витамина В2, β-каротина и дрожжей, обогащенных эргостеринами. При использовании соответствующих метаболических предшественников возможен также микробиологический синтез никотинамидных коферментов, например, никотинамидадениндинуклеотида. Белково-витаминные препараты. Особое внимание как источник белка привлекает микробная биомасса. Производство такой биомассы на дешевом сырье рассматривают как одно из средств устранения растущего белкового дефицита в питании животных. Наиболее интенсивное развитие получили промышленные методы микробиологического синтеза. кормовых дрожжей, применяемых в виде сухой биомассы как источник белка и витаминов в животноводстве. Для выращивания кормовых дрожжей используют углеводороды, гидролизаты различных отходов деревообрабатывающей промышленности, непищевых растительные материалов (подсолнечная лузга, стержни кукурузных початков и т.п.).

Для получения кормовых микробных препаратов в качестве компонентов среды могут быть также использованы этанол, метанол, уксусная кислота. Культивирование дрожжей на углеводородах требует высокой культуры производства. В частности, необходима надежная герметизация аппаратуры, исключающая вынос микробных клеток в окружающую среду. Ферменты. Продуцентами ферментов служат многочисленные представители микроскопических грибов, некоторые актиномицеты и другие бактерии. Технология получения ферментных препаратов упрощается, если фермент продуцируется в питательную среду.

При выделении внутриклеточных ферментов необходимо предварительно разрушить клетки микроорганизмов. Для исследовательских работ, аналитических целей и т. п. обычно получают ферменты в виде гомогенных (индивидуальных) белков. При промышленной переработке сельскохозяйственного. сырья в пищевой промышленности иногда применяют комплексные ферментные препараты. Так, при переработке растительного сырья ферментный комплекс должен содержать целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы, протеазы и некоторые другие ферменты. Один из важнейших ферментов, получаемый с помощью микробиологического синтеза глюкоизомераза, катализирующая изомеризацию глюкозы во фруктозу. Образующийся глюкозо-фруктозный сироп используют в пищевой промышленности вместо сахарозы. В любом живом организме аминокислоты расходуются прежде всего на биосинтез первичных метаболитов ферментных и неферментных белков. Следовательно, кроме биосинтеза аминокислот de novo, возможен другой путь их получения, а именно из гидролизатов соответствующих белков (триптофан разрушается при кислотном гидролизе), в том числе из нативной биомассы микробных клеток.

Получение ферментативных белковых гидролизатов из рыбного сырья. Малоценное, некондиционное рыбное сырье, отходы рыбоперерабатывающей промышленности, а также малоизученные и нетрадиционные виды гидробионтов являются крупным источником полноценного белка, который может стать доступным для практического использования при применении эффективных научно-обоснованных технологий их переработки. В настоящее активно исследуется ферментативный гидролиз рыбного сырья и пути оптимизации этого процесса. В качестве протеолитических агентов часто используют Алкалазу или Флаворзим, имеющих соответственно микробное и грибное происхождение. Много лет ведутся исследования ферментативного способа переработки малоценных видов рыб для получения белковых концентратов и гидролизатов для пищевых продуктов. Ряд научных работ посвящен описанию различных способов переработки рыбного сырья и получению из них белковых гидролизатов. Изучаются функциональные свойства ферментативных гидролизатов и кинетика процесса их получения. В работах подробно изучены кинетические закономерности процесса ферментативного гидролиза белковых веществ и предложены модели определения констант гидролиза. Также описаны химические и физико-химические характеристики сырья и гидролизатов и возможные пути и перспективы применения последних в науке и промышленности. Ферментативные белковые гидролизаты предлагается использовать в качестве кормовых добавок, пищевых ингредиентов или компонентов медицинских препаратов. Уже разработаны технологии применения гидролизатов из гидробионтов в качестве основ для функциональных продуктов питания. В область научных интересов ряда авторов входит изучение протеолитической активности тканей гидробионтов и кинетические закономерности процесса гидролиза. Исследуется также возможность производства кормовых добавок и микробиологических питательных сред на основе рыбных белковых гидролизатов. Способы получения белковых гидролизатов. Одним из важных направлений в производстве продуктов из гидробионтов является их глубокая переработка, т.е. производство белковых гидролизатов – продуктов с высоким содержанием ценных биологически активных соединений: свободных аминокислот и полипептидов. В общем виде гидролиз белка представляет собой расщепление белковой молекулы с разрушением C-N связи ее первичной структуры. Этот процесс протекает под действием катализатора, в роли которого могут выступать кислоты и основания (в этом случае гидролиз называется химическим), или протеолитические ферменты (ферментативный гидролиз). Химический гидролиз белка, в частности кислотный гидролиз с использованием НСl или H2SO4 в качестве катализатора, является широко распространенным способом получения гидролизатов. В зависимости от концентрации используемой кислоты и температуры гидролиза время процесса может изменяться от 3 до 24-х часов. Например, гидролиз в присутствии серной кислоты проводят в течение 3÷5 часов при температуре 100÷130 °С и давлении 2÷3 атмосферы; в присутствии соляной в течение 5÷24 часов при температуре кипения раствора под небольшим давлением. При действии кислоты гидролиз белков достигается максимальная глубина расщепления белка и исключается возможность бактериального загрязнения гидролизата, что особенно важно в медицине. Однако этот способ имеет недостаток при таких достаточно жестких условиях гидролиза происходит увеличение не только количества аминного азота за счет образования низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот, но и аммиака, что указывает на разрушение самих аминокислот. Так в ходе гидролиза происходит разрушение триптофана, треонина, серина, дезаминирование аспарагина и глутамина, разрушение витаминов. Особое внимание следует уделять сохранности цистеина, так как он разрушается в достаточно большой степени и при кислотном гидролизе животного сырья. Продукты кислотного гидролиза имеют темно-коричневую окраску, что обусловлено образованием гуминовых веществ в результате полного разложения молекул белка и продуктов реакции Майяра. Удаление окрашенных соединений осуществляется с помощью активированного угля. Однако уголь адсорбирует некоторое количество аминокислот, а также способствует окислению цистина, который является биологически важной аминокислотой, разрушение которой нежелательно. Кроме того, при нейтрализации кислотных гидролизатов образуется большое количество побочных продуктов: хлоридов или сульфатов. Последние являются особенно токсичными для организма.

Во избежание разрушения лабильных аминокислот в процессе получения кислотных гидролизатов, некоторые исследователи использовали мягкие режимы гидролиза в атмосфере инертного газа, а также добавляли к реакционной смеси антиоксиданты, тиоспирты или производные индола. Щелочной способ редко используют для получения гидролизатов, поскольку при таком способе наблюдается рацемизация аминокислот (часть ά-аминокислот превращается в D-аминокислоты) и почти полное разрушение цистеина, лизина, цистина и аргинина. Также при щелочном гидролизе белков образуются остатки лантионина и лизиноаланина, которые являются токсичными для организма человека и животных. Кислотный и щелочной гидролиз имеют, кроме указанных, еще существенные ограничения, связанные с агрессивностью среды, что приводит к быстрой коррозии оборудования и вызывает необходимость соблюдения жестких требований техники безопасности. Таким образом, подобные технологии являются достаточно трудоемкими, химически вредным и экологически опасными, а сами гидролизаты нуждаются в последующей очистке с использованием сложной аппаратуры (ионообменные колонки, ультрафильтрационные мембраны и т.п.). Альтернативой химического расщепления белков служит ферментативный гидролиз, который осуществляется с помощью катализаторов белковой природы – ферментов, синтезируемых живой клеткой и активирующих биохимические процессы.

Ферментативный способ гидролиза является более предпочтительным по сравнению с химическими методами, т. к. ферменты обладают значительно более высокой специфичностью и эффективностью каталитического действия, а сам ферментативный гидролиз проводится в «мягких» условиях (при температуре 35÷50 °С, значениях pH, близких к нейтральному, и атмосферном давлении), что способствует сохранению в готовом продукте (гидролизате) биологически активных веществ. В отличие от гидролизата, полученного химическим способом, аминокислоты в ферментативном гидролизате практически не разрушаются, не вступают в дополнительные реакции (рацемизация и другие) и присутствуют в нем в том же составе и соотношении, что и в исходном сырье.

Кроме того, ферментативный гидролиз разрушает связь белка с жиром, что позволяет легко отделить последний от исходного сырья и делает гидролизат стойким при хранении. Реакции, катализируемые ферментами, проходят без образования побочных продуктов. В процессе ферментативного гидролиза образуется сложная смесь продуктов распада белка, имеющих различную молекулярную массу. Соотношение продуктов зависит от свойств применяемого фермента, используемого сырья и условий проведения процесса. Гидролизаты, полученные методом ферментативного гидролиза, обычно содержат 10 ÷ 15 % общего азота и 3,0 ÷ 6,0 % аминного азота. Технология ферментативного гидролиза белков. Для расщепления белков к субстрату, который представляет собой негидролизованное белоксодержащее сырье, добавляют очищенные ферментные препараты или измельченные пищеварительные органы рыб или теплокровных животных, содержащие протеолитические ферменты. Если расщепление белка идет под действием гидролитических ферментов, содержащихся в самом субстрате, то процесс называют автопротеолизом (или автолизом). В случае использования автопротеолиза сырье должно обладать достаточно активным комплексом протеолитических ферментов. Также необходимо создать оптимальные условия (pH, температура) для их действия. Некоторые виды рыб (например, килька, мойва или сайка) обладают активной ферментной системой. После непродолжительного гидролиза при повышенной температуре (до 65 °С) структура белковых веществ разрушается до крупных высокомолекулярных полипептидов.

Протеолитические ферменты других видов рыб (красноперки, тарани) в меньшей степени активны и менее устойчивы к воздействию повышенной температуры. Степень дезагрегации белка при автолизе тканей этих видов рыб в оптимальных условиях (при температуре 50 °С, рН 6,3) в течение 5 часов составляет чуть более 10 %. Вероятно, достигнутая глубина гидролиза является недостаточной, т.к. практически не позволяет получать биопродукты определенной функциональной направленности. В случае низкой активности собственных ферментных систем сырья к субстрату добавляют микроорганизмы или ферментные препараты. В качестве таких препаратов используют комплексы ферментов животного, растительного или микробного происхождения, характеризующиеся широкой субстратной специфичностью и катализирующие расщепление не только пептидных связей, но и сложных эфирных связей в белковых макромолекулах.

К таким ферментным системам относят, например, культуру дрожжей Hansenula montovidec, бактериальные протеиназы, препараты протосубтилина, папаина, бромелина, трипсина и другие. Из ферментов микробного происхождения чаще всего используют бактериальные и грибные протеиназы. Количество вносимого ферментного препарата зависит от его активности. Продолжительность гидролиза зависит от вида сырья и составляет от 4 до 12 ч. Для ускорения процесса смесь необходимо перемешивать. Под воздействием комплекса протеолитических ферментов белок вначале разделяется на полипептиды. На этой стадии расщепляется около 1/3 начального количества субстрата. Отношение образовавшегося количества небелкового азота к общему азоту составляет 42 - 44 %. Эта стадия характеризуется высокой скоростью гидролиза. На второй стадии образуется 90 92% небелкового азота от общего азота. В дальнейшем рост небелкового азота прекращается. На третьей стадии дезагрегированные белки подвергаются дальнейшему распаду до низкомолекулярных продуктов гидролиза. Эти реакции протекают как последовательно, так и одновременно. Поэтому на начальной стадии протеолиза обнаруживается сложная смесь высоко- и низкомолекулярных продуктов (полипептиды и аминокислоты). С течением времени количество полипептидов уменьшается, а содержание аминокислот в гидролизате увеличивается. Однако добиться полного гидролиза белка до аминокислот практически не удается, так как активность ферментов снижается за счет ингибирования образующимися аминокислотами, которые взаимодействуют с активными группировками ферментов, за счет температурной инактивации или в результате автолиза. Согласно опубликованным данным, при ферментативном гидролизе степень гидролиза белковых молекул (отношение аминного азота к общему) составляет не более 40 50 %. Гидролиз белка приводит к полному нарушению гистологической структуры сырья и изменению его внешнего вида исходное сырье превращается в густую сметанообразную массу. В ходе гидролиза вода, удерживаемая белками в структуре тканей, переходит в свободное состояние, в ней растворяются продукты гидролиза белка, а также в виде эмульсий жир, высвобождающийся за счет разрушения жировой ткани и белково-липидных комплексов.

Традиционная технологическая схема получения ферментативных белковых гидролизатов из гидробионтов включает в себя следующие основные стадии: измельчение сырья, ферментативный гидролиз белков, входящих в состав сырья, инактивация фермента, удаление балластных примесей (поверхностный слой) и нерасщепленных белков (осадок), очистка от взвешенных частиц (осветление раствора) и сушка полученного гидролизата. В качестве сырья для производства гидролизата может быть использовано рыбное сырье любой жирности, так как в ходе технологического процесса предусмотрено обезжиривание (сепарирование) жидкой части субстрата. Под действием протеолитических ферментов, в частности, панкреатина или комплекса протеиназ, выделенного из гепатопанкреаса Камчатского краба гепатопанкреатина, в гидролизат превращается более 75 % исходного рыбного сырья, и только 25 % его остаётся в виде негидролизованной массы, состоящей в основном из крупных костей. По сравнению с химическими технологиями ферментативный способ получения гидролизатов обладает существенными достоинствами, главными из которых являются: доступность и простота проведения, незначительная энергозатратность и экологическая безопасность.