Лекция 4. Биотехнология микробных ферментных препаратов в переработке животного сырья (4 часа)

Ферменты — это природные катализаторы, которые ускоряют большинство химических реакций в биологических системах. Ферменты используются для продления срока хранения продуктов питания и напитков с древних времён. Тем не менее, их спрос в пищевой промышленности постоянно растёт. Роль ферментов как катализаторов была признана в XIX и начале XX веков. Первоначально роль дрожжевого экстракта в превращении глюкозы в этанол была открыта Эдуардом Бухнером в 1897 году. Позже было обнаружено, что за превращение отвечает фермент, присутствующий в дрожжевом экстракте. Сначала Джеймс Б. Самнер выделил и кристаллизовал чистый фермент уреазу и получил за это Нобелевскую премию (1946) (Hau и др., 2018). В пищевой промышленности ферменты используются для увеличения производительности, а также для улучшения текстуры, аромата, цвета и вкуса (Sharma et al., 2021). Кроме того, ферменты используются для получения сырья, такого как тесто для выпечки, для производства стандартных хлебобулочных изделий высокого качества. В производстве напитков ферменты используются для получения высококачественного пива и вина путём улучшения процесса пивоварения (Kuddus, 2018).Помимо этого, пищевая промышленность также предполагает использование ферментов при обработке мяса и производстве высококачественных питательных кормов для крупного рогатого скота (Trono, 2019). Мировой промышленный рынок ферментов оценивается в 6,95 млрд долларов США в 2022 году и, как ожидается, будет расти в среднем на 6,4% в год с 2023 по 2050 год. Предполагается, что увеличение потребления хлебобулочных изделий и соков ещё больше увеличит спрос на ферменты в промышленности (Size, 2022).

В глобальном масштабе некоторые микроорганизмы, такие как дрожжи, грибы и бактерии, были изучены с целью биосинтеза экономически целесообразных составов различных промышленных ферментов (Нигам, 2013). Ферменты могут расщеплять сложные соединения на простые мономерные фрагменты, например углеводы на простые сахара, которые являются органическими соединениями, регулирующими различные биологические процессы. Каждый фермент специфичен по отношению к определённым условиям, будь то субстрат, pH или температура, необходимые для катализа реакции, тем самым превращая реагент в стабильный конечный продукт. Ферменты, в отличие от неорганических катализаторов, очень избирательны, катализируя определённое изменение субстрата или разрывая ограниченный набор тесно связанных молекул или специфическую связь. В крупномасштабных процессах это снижает образование побочных продуктов (Аль-Мактари и др., 2019). Пищевая ценность и вкус обработанных пищевых продуктов улучшаются с помощью ферментов с помощью методов обработки пищевых продуктов. В настоящее времяна коммерческом уровне ферменты успешно используются в пищевой промышленности для производства сиропов, йогуртов, вина и пива, квасного хлеба и сыра (Singh & Kumar, 2019).Использование ферментов в различных отраслях привлекает внимание исследователей из-за их экологичности и особенно в связи с требованиями потребителей сократить использование химикатов в обработанных пищевых продуктах. Микробиологические источники представляют собой отличный выбор для удовлетворения возросшего спроса на ферменты и их применения в пищевой промышленности. В основном это связано с тем, что микроорганизмы легкодоступны, вырабатываются и размножаются быстрее, чем животные, и могут быть генетически модифицированы для повышения эффективности катализа, что подходит для различных условий в промышленной среде. О широком применении микробных ферментов сообщается в различных областях, таких как фармацевтика, сельское хозяйство, текстильная промышленность, кожевенное производство, производство бумаги, целлюлозы, моющих средств, переработка отходов и пищевая промышленность, что подчеркивает их необходимость в качестве важных инструментов в различных отраслях промышленности (Окпара, 2022). Некоторые ферменты используются для деполимеризации природных веществ благодаря их гидролитическому действию. Наиболее распространенными ферментами являются протеазы, которые нашли широкое применение в молочной и мыловаренной промышленности. Другими важными ферментами являются углеводы, в первую очередь амилазы и целлюлазы, которые используются в хлебопечении и текстильной промышленности (Кирк и др., 2002; Озатай, 2020). Благодаря достижениям современной биотехнологии возможна модификация генов, что очень важно для производства новых ферментов. Технология рекомбинантной ДНК позволяет управлять их структурой и функциями, особенно для коммерческого использования (Шривастава и др., 2019).Микробиологические ферменты привлекли значительное внимание в пищевой промышленности благодаря своим разнообразным функциям и сферам применения. В этом обзоре представлен всесторонний обзор роли микробиологических ферментов в пищевой промышленности, в котором подчеркивается их значение для повышения качества, вкуса, питательной ценности и экологичности продуктов питания. Этот обзор не только обобщает существующие знания, но и выявляет пробелы в знаниях, облегчает принятие решений, способствует инновациям и распространяет ценные сведения о микробиологических ферментах и их разнообразных сферах применения в пищевой промышленности. Цель этой статьи — объяснить ключевую роль микробных ферментов в формировании будущего пищевой промышленности путём подробного изучения различных типов ферментов, их источников, механизмов действия и промышленного применения. В статье также обсуждаются ключевые проблемы, такие как нормативные ограничения, стабильность ферментов, субстратная специфичность и потребительский спрос. Кроме того, рассматриваются перспективы использования микробных ферментов в будущем, включая новые тенденции и технологические достижения.

Достижения в области исследований ферментов позволяют предположить, что промышленные отходы могут быть преобразованы в нетоксичные, биоразлагаемые и экологически чистые продукты. Только 5% из более чем 3000 ферментов в настоящее время используются в качестве инструментов обработки в различных отраслях промышленности (Патель и др., 2023). Этот процент можно увеличить с помощью модификации микробов с помощью генной инженерии, чтобы улучшить микробы и производить более стабильные ферментные катализаторы в промышленных масштабах, что позволит использовать неиспользуемые источники (Gurung и др., 2013). Одним из основных недостатков использования ферментов в промышленности являются определённые жёсткие и неблагоприятные условия производства, особенно с учётом того, что эти биологические катализаторы представляют собой белки, которые могут потерять активность в случае денатурации. Например, наличие ингибирующих соединений в матрице для обработки, а также экстремальные условия температуры и давления могут негативно влиять на действие ферментов (Литтлчайлд, 2015; Сингх и Баджадж, 2016). Некоторые ферменты животного и растительного происхождения в отсутствие ингибиторов могут оптимально выполнять катализ при температуре 37 °C. Микроорганизмы в качестве источника используются для производства ферментов, чтобы решить эту проблему, и могут быть предпочтительнее растительных и животных источников для производства промышленных ферментов. Микроорганизмы легко культивировать в дешёвых питательных средах, их скорость роста выше, а ферментная матрица менее сложная по сравнению с растениями и животными. Микробиологические ферменты экономически выгодны, так как их легко извлекать, они стабильны в разных партиях, их легко модифицировать, а производство включает меньше переменных, чем производство из растительных и животных источников. Ферменты, вырабатываемые микроорганизмами, более стабильны по сравнению с их аналогами в растениях и животных. Кроме того, они обеспечивают большее каталитическое разнообразие для промышленного применения (Сабу, 2003).Микроорганизмы вырабатывают несколько ферментов, которые улучшают вкус, текстуру и аромат продуктов питания, что даёт ряд преимуществ пищевой промышленности. Тем не менее существует значительная потребность в ферментах, которые демонстрируют оптимальную производительность в сложных промышленных условиях в различных отраслях. Эти ферменты востребованы благодаря своей способности облегчать производство товаров в экстремальных условиях обработки, включая высокие температуры, различные уровни pH и повышенное давление (Okpara, 2022).

Очистка ферментов представляет собой важнейший этап в промышленном применении ферментов. Смесь ферментов, полученная в результате микробной ферментации для получения конкретного фермента, часто содержит примеси и растворители, которые могут влиять на кинетику ферментов, снижая качество и конечный выход фермента. Однако очищенные ферменты обладают повышенной стабильностью и более высокой специфичностью по отношению к своему субстрату. Одним из самых простых методов очистки ферментов, применимых в различных условиях, является осаждение. Этот метод включает добавление органического растворителя или соли, что приводит к осаждению фермента. Этот метод обычно называют высаливанием. Полученный осадок можно собрать с помощью центрифугирования или фильтрации (Larsson & Mosbach, 1979). Другим широко используемым методом очистки ферментов является хроматография. Этот метод включает разделение белковой смеси с помощью колонки, содержащей полярную неподвижную фазу и неполярную подвижную фазу, до получения однородной смеси. В зависимости от размера, заряда и сродства фермента можно использовать различные методы хроматографии. Выбор типа колонки зависит от конкретных требований процесса очистки (Родригес и др., 2020). В пищевой промышленности электрофорез является еще одним методом, используемым для экстракции ферментов. Этот метод предполагает разделение белков по их заряду и размеру с помощью электрического поля (Серменьо и др., 2020). Для разделения таких ферментов, как липазы, пектиназы и амилазы, применялись другие методы, такие как ультрафильтрация (Li et al., 2021; Perreault et al., 2021; Sharma et al., 2001). Ферменты можно очистить с помощью тщательного процесса, обеспечивающего высокое качество, что позволяет изучать их кинетику и разрабатывать новые ферменты с улучшенными свойствами. 

Ферменты способствуют улучшению здоровья человека благодаря их применению в пищевой промышленности, что позволяет производить высококачественные и питательные продукты питания. Ферменты используются в производстве продуктов питания с древних времён (Окпара, 2022), а продажа пищевых ферментов в Индии показана на рис. 1. Жители некоторых островов Тихого океана использовали папайю для размягчения мяса, и это было одним из первых применений ферментов в пищевой промышленности (Gomes et al., 2018). Способность ферментов превращать субстраты в продукты считается важным показателем для их стандартного использования в пищевой промышленности. Например, ферменты можно использовать вместе с биосенсорами для определения свежести молочных овощей и изменений их качества в процессе обработки, а также в качестве неотъемлемого компонента «умной» упаковки (Kaur & Kaushal, 2019). В таблицеe 1 представлен обзор областей применения некоторых ферментов, которые широко используются в пищевой промышленности. Развитие технологий привело к созданию новых ферментов с различными сферами применения и особенностями, и новые области применения все еще исследуются. Микробиологические ферменты предпочтительнее растительных и животных источников из-за их большей стабильности, простоты производства, меньших требований к пространству и времени для их выращивания, экономической эффективности, высокой однородности и возможности модификации и оптимизации процесса. (Гурунг и др., 2013; Равиндран и др., 2018) Микроорганизмы, такие как бактерии, дрожжи и грибы, а также их ферменты широко используются в приготовлении некоторых продуктов питания для улучшения вкуса и текстуры, что приносит значительную экономическую выгоду предприятиям (Равиндран и др., 2018). Применение микробных ферментов было обнаружено в нескольких областях пищевой промышленности, включая молочное производство, выпечку, переработку продуктов питания, корма для скота, фруктовые и овощные соки, напитки и кондитерские изделия (Okpara, 2022).

Различные типы ферментов, включая каталазу, аминопептидазу, протеазы, лактопероксидазу, липазы и трансглутаминазу, нашли применение в молочной промышленности. Эти ферменты помогают увеличить срок годности и отличаются от коагулянтов. В молочной промышленности различные ценные продукты, такие как сыр, йогурт, сироп и аналогичные продукты, производятся с использованием ферментов, которые могут быть разработаны для повышения качества таких пищевых продуктов (Abada, 2019). Сычужный фермент считается самым известным экзогенным ферментным комплексом, используемым в молочной промышленности, и был известен ещё в 6000 году до н. э. Ренин является основным фактором свертывания белка в сычужном ферменте и обладает ферментативным и неферментативным действием, которое приводит к свертыванию казеинового компонента молока (Озатай, 2020; Абада, 2019). Молочные телята были источником сычужного фермента, но не могут удовлетворить современные потребности из-за роста мирового спроса на сыр, что привело к поиску других способов производства реннина (Nicosia et al., 2022), в результате чего был синтезирован химозин — генетически модифицированная версия реннина, вырабатываемая бактериями. Считается, что до 70% сыров производятся с использованием биоинженерного химозина (Furtado, 2022).Доступность химозина стала очень важной, поскольку он сокращает количество телят, которых забивают для производства сычужного фермента, и удовлетворяет спрос потребителей на этичное производство продуктов питания. К другим ферментам, используемым в молочных продуктах, относятся протеазы, липазы и лактазы, которые являются представителями семейства гидролаз (Zaheer & Gupta, 2019).

Протеазы — это гидролазы, которые расщепляют связи между пептидами и аминокислотами (Гурумаллеш и др., 2019). Протеазы представляют собой разнообразную и сложную группу ферментов, характеризующихся различной специфичностью в отношении субстратов, наличием нескольких активных центров, разнообразными каталитическими процессами, оптимальными диапазонами pH, температурными предпочтениями и профилями стабильности. Некоторые протеазы, такие как трипсин поджелудочной железы, химотрипсин, пепсин и химозин, получают из животных, в то время как другие, такие как папаин, бромелайн, актинидин и фицин, получают из растений (Martnez-Medina и др., 2019). В последнее время растет интерес к получению этих протеаз из генетически модифицированных микробных источников в связи с растущим спросом на ферменты в промышленности (Санроман и Дейв, 2017; Мартенс-Медина и др., 2019; Кокабас и др., 2022)). Эти ферменты могут быть экзогенными (амино- или карбоксипептидазы, которые расщепляют конечные аминокислоты цепи) или эндогенными (протеиназы, которые расщепляют пептидные связи внутри полипептидной цепи. Классы протеаз, в активных центрах которых содержатся серин, тиол, ионы металлов или аспарагиновая кислота, — это сериновые, тиоловые, металлопротеазы и кислотные протеазы.

Протеолитические ферменты используются для придания привлекательного вкуса и изменения текстуры в процессе созревания сыра, а также для снижения аллергенности продуктов из коровьего молока. (Ардо и др., 2017). Другие протеолитические ферменты очень эффективно гидролизуют пептидные связи в каппа-казеине в процессе производства творога для изготовления сыра. Кроме того, было обнаружено, что протеолитические ферменты снижают аллергенность некоторых ферментированных молочных продуктов. Мякоть и шелуха плодов растения Withania coagulans обладают протеолитической активностью. Растительные препараты из сушёных плодов используются для приготовления сыра при pH от 4 до 6 (Каземипур и др., 2017). Недавнее исследование показало, что протеаза, свертывающая молоко, из штамма Aspergillus oryzae DRDFS13MN726447 может улучшить органолептические характеристики или качество сыра в целом (Mamo, 2020).

Липазы — это катализаторы, которые способствуют расщеплению длинноцепочечных триацилглицеринов и являются очень универсальными инструментами для использования в нескольких промышленных процессах. Липаза в основном используется для облегчения отделения молока от жира, тем самым улучшая вкусовые качества сыра (Jooyandeh и др., 2009). Липаза используется в качестве вспомогательного средства для улучшения вкуса сыра (Selamoglu, 2020). Вкус, возникающий в результате гидролиза молочного жира, обусловлен высвобождением ненасыщенных жиров. Липазы, используемые при производстве определенных сортов сыра, часто гидролизуют широкий спектр триглицеридов. Фосфолипаза A1, которая расщепляет фосфолипиды на жирные кислоты и другие лизофосфолипиды, рекомендуется для использования в молочной промышленности из-за ее высокой специфичности и минимальной активности в отношении ди- и триглицеридов. (Кокабас и др., 2022). Кроме того, липазы используются в сливочном масле и маргарине для улучшения вкуса и продления срока хранения различных хлебобулочных изделий (Aravindan и др., 2007).Липазы также используются для получения структурированных липидов, обладающих органолептическими свойствами, сравнимыми с какао-маслом, с температурой плавления 37 °C, что обусловлено наличием пальмитиновой и стеариновой кислот в качестве доминирующих жирных кислот в составе триацилглицерина (Jaeger & Reetz, 1998; Sharma et al., 2001). Животныеальфа-липазы вырабатываются телятами и овцами, тогда как микробные липазы вырабатываются в основном дрожжами и грибами (Candida, Yarrowia, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Rhizomucor и Thermomyces) (Hasan et al., 2006). Липазы, получаемые из животного сырья, гидролизуют жиры короткой и средней длины, в то время как микробные липазы, используемые в производстве сыра, менее специализированы в гидролизе конкретных жиров. Гидролиз липидов с более короткой цепью более благоприятен, чем гидролиз ненасыщенных жиров с более длинной цепью, так как первые улучшают вкус различных видов сыра. Ненасыщенные жиры с более длинной цепью после гидролиза могут приобретать мыльный или безвкусный характер (Алкан и др., 2007). Липазы катализируют гидролиз триацилглицеринов (ТАГ), образуя моноацилглицерины (МАГ), диацилглицерины (ДАГ), глицерин и свободные жирные кислоты в процессе приготовления хлеба (Чжэн и др., 2023).

Лактаза гидролизует лактозу до глюкозы и галактозы. Помимо молока, β-галактозидаза может использовать сыворотку, побочный продукт производства сыра, в качестве источника лактозы. Этот фермент может превращать лактозу сыворотки в сиропы, которые используются в хлебопекарной и кондитерской промышленности (Movahedpour и др., 2022). На рынке представлены два вида лактаз: нейтральные лактазы и кислые лактазы, которые используются в молочных продуктах и пищевых добавках соответственно. Эти ферменты, принадлежащие к различным семействам гликозилгидролаз, сильно различаются по своей последовательности, структуре и метаболическим характеристикам (Деккер и др., 2019). В коммерческих целях лактаза используется для производства продуктов без лактозы, предназначенных для людей с непереносимостью лактозы. Кроме того, он используется при производстве замороженного йогурта для придания ему кремовой консистенции и улучшения общего вкуса (Okpara, 2022).

В молочных продуктах лактаза используется не только для гидролиза лактозы, но и для придания продукту большей сладости. Лактаза делает молоко более сладким, потому что лактоза обладает лишь 20% сладости сахарозы, в отличие от смеси глюкозы и галактозы, образующейся в результате гидролиза, которая обладает примерно 70% сладости сахарозы (Хорнер и др., 2011). Ранее. Лактаза использовалась в молочной промышленности для производства продуктов на основе молока (например, сыворотки). Это один из привлекательных способов улучшить их усвояемость, который лучше всего подходит для пациентов с непереносимостью лактозы, тем самым предотвращая обезвоживание и диарею (Махони, 1997). Лактаза играет важную роль в обработке сыворотки в молочной промышленности, поскольку при обработке сыворотки лактоза связана с критическими экологическими проблемами, такими как повышенная биологическая потребность в кислороде (БПК) и химическая потребность в кислороде (ХПК) сыворотки (Khider, 2004; Johansen et al., 2002). Образование галактоолигосахаридов (ГОС) в результате гидролитического расщепления лактозы является важным применением этого фермента. Активность β-галактозидазы в отношении трансгликозилирования в основном отвечает за выработку GOS, который, как сообщалось ранее (Гибсон и Ванг, 1994), используется в качестве пребиотического пищевого ингредиента.

Коммерческая бета-галактозидаза или лактаза (EC 3.2.1.23) часто используется при производстве молочных продуктов без лактозы, особенно в процессах, связанных с относительно низкими температурами. Модифицированный вариант бета-галактозидазы, полученный в результате направленной эволюции, обладает высокой активностью в промышленных условиях, характерных для переработки молока, — в частности, при использовании в качестве субстрата лактозы, pH буферной среды 6,75 и температуре 8 °C (Mamo и др., 2020).

Повышение активности этого фермента в отношении трансгликозилирования было достигнуто путем получения термоустойчивого варианта бета-галактозидазы Thermotoga maritima с помощью рационального проектирования. Этот модифицированный фермент демонстрирует повышенную специфичность в отношении биосинтеза галактоолигосахаридов, пребиотического соединения (Рамадан, 2019). В дополнение к вышеперечисленным ферментам трансглутаминаза (TG) считается широко используемым ферментом при производстве йогурта, замороженных десертов и мороженого для улучшения текстуры и стабильности при хранении.

Улучшение выхода сока, осветление и разжижение мякоти возможны при ферментативной обработке фруктового сока, которая более выгодна, чем традиционная обработка (Рамадан, 2019). В предыдущем исследовании изучалась ферментация отходов ананаса с высоким содержанием клетчатки для производства ферментов. Ферментация отходов ананаса с помощью Lactobacillus casei привела к производству ксиланазы и целлюлазы (Сиванешан и др., 2022). Такой подход позволяет перерабатывать фруктовые отходы с использованием микробных ферментов для производства других полезных промышленных катализаторов. Amylases нашли несколько применений в пивоваренной промышленности, широко применяясь в пивоваренном ячмене для улучшения производства сахаров, которые могут быть ферментированы в спирт (Meshram et al., 2019). Продувымывание напитков, таких как пиво, вино и фруктовые соки, связано с различными проблемами, такими как образование дымки, помутнение и потемнение из-за присутствия фенольных соединений, которые создают проблемы. Лакказа, марганцевая пероксидаза и лигниновая пероксидаза являются перспективными ферментами для улучшения цвета напитков за счёт удаления фенольных соединений для получения прозрачных напитков (Чоудхари и др., 2019).

Пектиназы катализируют различные процессы в пектиновых соединениях, содержащихся в клеточных стенках растений (Dey & Maity, 2023). Пектинэстераза катализирует деацетилирование и деметилирование пектина, пектолиаза катализирует трансэлиминационное расщепление метилового эфира 1,4-D-галактозы, а полигалактуроназа катализирует гидролиз 1,4-гликозидных связей (Сатапати и др., 2020).

Пектиназы играют важнейшую роль в производстве фруктовых соков, расщепляя пектин, содержащийся в клеточных стенках фруктов. Этот процесс улучшает извлечение сока, его вкус, прозрачность, фильтруемость и общий выход. В производстве напитков, особенно на этапе сушки при влажной обработке для производства кофе, пектиназы используются для увеличения выхода, улучшения аромата и вкуса, а также сокращения времени обработки. Кроме того, на предприятиях по переработке какао пектиназы используются для полного удаления слизистых оболочек, окружающих какао-бобы, улучшения аромата и вкуса, а также для сокращения времени обработки, что повышает качество готового кофе. Чайные листья обрабатывают пектиназами, чтобы снизить содержание пектина и ускорить процесс ферментации при заваривании чая. В литературе описаны несколько рекомбинантных пектиназ из нескольких источников, таких как A. niger (Сюй и др., 2015) и Penicillium purpurogenum (Перес-Фуэнтес и др., 2014), а также кислая эндополигалактуроназа из A. niger (Цзян и др., 2013), экспрессируемые в P. pastoris для получения соков.

В настоящее время пектиназы из разных источников объединяют в рекомбинантные ферменты для их использования в производстве соков. Например, Novoshape, рекомбинантная пектинметилэстераза из A. aculeatus, экспрессируется в A. oryzae. Другие препараты включают пектинлиазы из A. niger и P. purpurogenum, пектинметилтрансферазу и эндополигалактуроназу из A. niger, экспрессируемые в P. pastoris (Trono, 2019). Биофункциональный фермент (S6A), образованный путем объединения каталитических доменов пектинметилтрансферазы (S6PE) и полигалактуроназы (S6PG) в Penicillium oxalicum и экспрессируемый в P. pastoris. Этот фермент обладал свойствами обоих ферментов и, следовательно, разрушал пектиновые стенки, а также осветлял сок (Tu et al., 2014).

Гидролиз сложных эфиров до спирта и кислоты катализируется классом ферментов гидролаз, называемых эстеразами. Этот фермент может гидролизовать короткоцепочечные глицериды до жирных кислот и глицерина (Raveendran et al., 2018). В производстве напитков ферулоилэстераза используется для получения феруловой кислоты, которая затем применяется для производства ароматических соединений. Ванилин является ключевым элементом ванили, который используется для улучшения вкуса напитков. Эстеразы также используются в фруктовых соках для изменения и улучшения вкуса жира (Галладж и др., 2014). Эстеразы в основном вырабатываются в больших количествах микроорганизмами, такими как Bacillus licheniformis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus amylovorus. Bacillus licheniformis вырабатывает термостабильную эстеразу, которая была гетерологично экспрессирована в E. coli для гидролиза эфиров (Macarie & Baratti, 2000).

Лакказа — это медьсодержащая оксидоредуктаза, которая представляет собой самую большую подгруппу медьсодержащих ферментов и является одним из наиболее изученных ферментов в мире (Raveendran et al., 2018). Она идеально подходит для различных коммерческих целей из-за низкой субстратной специфичности, но обладает сильным потенциалом использования кислорода для расщепления фенольных соединений (Mayolo-Deloisa et al., 2020). Лакказы окисляют множество различных соединений, в том числе фенолы, ароматические амины и аскорбат (Окпара, 2022). Сообщалось, что лакказы вырабатывают грибы, бактерии, почвенные водоросли и некоторые насекомые (Януш и др., 2020). Благодаря своей адаптивности, стабильности и разнообразию субстратов лакказы в последние годы нашли множество коммерческих применений. Он широко используется в различных отраслях пищевой промышленности, в том числе для желирования пектина сахарной свеклы, стабилизации вина и пива, а также при производстве напитков (Deloisa и др., 2020). Фенольные вещества в соках ухудшают качество, цвет и вкус напитков, снижая их экономическую ценность. Сообщается, что лакказа обладает высокой эффективностью при удалении этих фенольных соединений из соков. В виноделии лакказу используют для стабилизации вина, регулируя содержание в нём фенольных соединений (Osma и др., 2010). Лакказу используют для удаления кислорода, чтобы продлить срок хранения вина (Okpara, 2022). Лакказу можно использовать для продления срока хранения пива, добавляя фермент в конце процесса пивоварения, который окисляет нежелательные фенольные соединения (Osma и др., 2010). Как и в процессе производства вина, этот фермент также удаляет кислород на последнем этапе производства пива, тем самым продлевая срок его хранения и улучшая качество.

Протеозы также могут способствовать предотвращению образования помутнения во время брожения вина. Кислотные протеазы из Saccharomyces fibuligera и Torulopsis magnolia могут использоваться для предотвращения помутнения, а кислотные протеазы из Aspergillus niger делают пиво прозрачным (Mamo & Assefa, 2018).

Хлебопекарная промышленность

Выпечка — это универсальный процесс производства таких продуктов, как хлеб, пироги, печенье и пирожные. Несмотря на то, что использование ферментов в хлебопекарной промышленности не является чем-то новым, современные достижения в области ферментных технологий, биотехнологий и биохимии изменили представление о ферментах как о средстве обработки при производстве выпечки. Увеличение срока хранения хлеба может быть достигнуто за счёт использования глюкозооксидаз, ксиланаз и амилаз (Dahiya и др., 2020). Основными привлекательными свойствами хлебобулочных изделий являются их длительная свежесть и мягкость. Эти ферменты можно использовать по отдельности или в виде смесей, которые можно добавлять в муку и тесто для улучшения вкуса и текстуры, а также для улучшения процесса выпечки (Авендано и др., 2016). Добавление различных ферментов не только улучшает вкус, но и облегчает переваривание белков пшеницы. Этот процесс одновременно сокращает время созревания и улучшает консистенцию^. (Мамо и Ассефа, 2018).

α-амилазы

α-Амилазы — это натуральные ферменты, расщепляющие крахмал, которые гидролизуют полисахаридные α-1,4-гликозидные связи, в результате чего образуются короткоцепочечные декстрины (Sindhu и др., 2017). α-Амилазы широко используются в пищевой промышленности для разжижения крахмала, приготовления пищи, пивоварения и улучшения пищеварения. Они часто используются в хлебопекарной промышленности в качестве усилителей вкуса и антислеживающих агентов для улучшения качества хлеба (Sindhu и др., 2017). α-амилазы добавляются в тесто во время выпечки, чтобы помочь расщепить крахмал на более мелкие декстрины, которые затем ферментируются дрожжами. Это улучшает вкус, внешний вид и стабильность хлеба (Couto & Sanromán, 2006). α-amилазы из Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, или Bacillus amyloliquefaciens используются для основной части осахаривания крахмала (Van der Maarel et al., 2007). напротив, α-амилаза, выделенная из этих источников, была чувствительна к кислотным условиям и была заменена генно-инженерной (остатки гистидина в активном центре были заменены остатками Arg и Asp), которая обладала высокой стабильностью и активностью по сравнению с диким типом (Liu et al. 2017).Этот фермент ускорял различные процессы, включая разжижение крахмала, осахаривание и ферментацию, при которых pH суспензии обычно составляет менее 6,0 (Чжан и др., 2019). Для производства мальтозного сиропа с высоким содержанием мальтозы α-амилазу из Rhizopus oryzae модифицировали с помощью сайт-направленного мутагенеза, чтобы повысить устойчивость к высокой температуре (60 °C) и стабильность при более низких уровнях pH (4,0–4,5) по сравнению с ферментом дикого типа (Li et al., 2018).

Protease

Существует два типа протеаз: экзопептидазы и эндопептидазы. Эндопептидазы разрывают пептидные связи вдали от амино-или карбоксиконцов субстрата, в то время как экзопептидазы расщепляют пептидные связи вблизи этих концов (Ganzle et al., 2008). Большая часть протеолитической активности пшеничной и ржаной муки обусловлена ферментами аспарагиновой кислоты и карбоксипептидазы, которые активны при кислых значениях рН (Bombara & Anon, 1997). Кроме того,предположительно, глютен частично связан с протеазами аспарагиновой кислоты пшеницы. Общие сведенияпри промышленном производстве вафель, крекеров, хлебобулочных изделий и хлеба используются протеазы. Этитипы ферментов можно использовать, чтобы сократить время, необходимое для замешивания теста, обеспечить однородность, контролировать текстуру хлеба и улучшить вкус (Raveendran и др., 2018). Кроме того, в то время как протеолиз расщепляет пептидные связи, протеазы, по сути, заняли место бисульфита, который изначально использовался для регулирования консистенции за счёт уменьшения количества дисульфидных связей в белках клейковины. Кислотная протеаза, получаемая из грибов, используется для изменения смесей с высокой концентрацией глютена при производстве хлеба. При добавлении протеаз в смесь они частично гидролизуются, становясь эластичными и простыми в растяжении и замешивании (Di Cagno и др., 2003; Саллех и др., 2006). Протеозы, полученные из таких микроорганизмов, как Aspergillus oryzae и Aspergillus niger, могут расщеплять глютен на водорастворимые пептиды. Это ферментативное действие приводит к уменьшению количества иммуногенных пептидов глютена, которые являются основной причиной аллергии на глютен, и одновременно увеличивает концентрацию аминокислот (Эредиа-Сандован и др., 2016).

Ксиланазы

Ксиланазы — это гидролитические ферменты, вырабатываемые различными видами Aspergillus и Trichoderma. В хлебопечении ксиланазы чрезвычайно полезны, поскольку было доказано, что они увеличивают объём хлеба, улучшают структуру мякиша и уменьшают липкость. Ксиланазы используются для продления срока хранения хлеба и предотвращения его черствения. Кроме того, они расщепляют нерастворимый арабиноксил, образуя растворимый в воде ксилан. Этот процесс приводит к перераспределению воды в тесте, улучшая формирование клейковиной сети. В результате сухое тесто становится более эластичным, растяжимым и мягким. Благодаря этим свойствам спрос на этот фермент в хлебопекарной промышленности продолжает расти (Paucean и др., 2016). Ксиланазы особенно активны во время повторной агломерации клейковины с последующим расщеплением клейковины, что влияет на реологические свойства клейковины (Гошал и др., 2017). Изменение исходной ксиланазы путем сайт-направленного мутагенеза привело к повышению специфичности и термостабильности (50–60 °C) и может быть эффективным в щелочных условиях (pH 7–10) для получения ксилоолигосахаридов из пшеничной соломы (Faryar et al., 2015).Водорастворимый арабиноксилан расщепляется ксиланазой Aspergillus niger, которая также снижает молекулярную массу и вязкость теста (Romanowska et al., 2003). Аналогичным образом, ксиланаза Bacillus subtilis преимущественно растворяет нерастворимые в воде арабиноксиланы и повышает вязкость теста, негативно влияя на агрегацию клейковины (Courtin & Delcour, 2002).

Липазы

Липазы катализируют гидролиз триацилглицеринов (ТАГ), в результате чего образуются свободные жирные кислоты, глицерин, моноацилглицерины (МАГ) и диацилглицерины (ДАГ) в процессе приготовления хлеба (Сандовал, 2018). Липазы увеличивают объём хлеба и улучшают его качество. Химические улучшители теста, такие как диацетилвинные эфиры моноглицеридов (DATEM), могут быть заменены микробными липазами (Геритс и др., 2015). Липазы первого поколения улучшают обрабатываемость теста, повышая его прочность и стабильность, а также улучшая реологию. При добавлении липаз они не только увеличивают объем хлеба, но и улучшают форму мякиша и делают его более мягким (Дахия и др., 2020).

Лакказа

Лактаза используется в хлебопекарной промышленности из-за её способности образовывать поперечные связи с биополимерами. Использование лакказы повышает технологичность теста в хлебопекарной промышленности за счёт улучшения консистенции, прочности и снижения липкости теста (Mayolo-Deloisa и др., 2020). Кроме того, она повышает эластичность и объём продукта (Labat и др., 2000).

Микробные ферменты в пищевой промышленности

Необходимые ферменты либо недоступны, либо не способны эффективно выполнять необходимые преобразования. Технологии поиска и обнаружения могут быть использованы для создания оптимальной библиотеки ферментных препаратов, пригодных для использования в органическом синтезе, что обеспечивает дальнейший прогресс. Развитие технологий привело к созданию новых ферментов с различными функциями и спецификой, а также к появлению новых областей применения. Микробные ферменты предпочтительнее ферментов животного и растительного происхождения из-за их более высокой стабильности, простоты производства, меньших требований к пространству и времени для их выращивания, экономичности, высокой однородности и возможности оптимизации и модификации процесса (Gurung и др., 2013; Raveendran и др., 2018). Микроорганизмы, такие как грибки, дрожжи и бактерии, а также их ферменты, обычно используются для улучшения вкуса и текстуры различных пищевых продуктов, что даёт значительные экономические преимущества для промышленности (Raveendran и др., 2018). Ферменты микроорганизмов (Таблица 2) было установлено, что они полезны в различных областях пищевой промышленности, включая обработку и упаковку продуктов питания, выпечку, производство молочных продуктов, кормов для скота, фруктовых и овощных соков, нефтепереработку, кондитерские изделия и напитки (Okpara, 2022). В следующих разделах представлена подробная и актуальная информация о различных пищевых ферментах микробного происхождения.

Липазы

Липазы — это легко адаптируемые ферменты, которые используются в различных промышленных процессах. Они способствуют гидролизу длинноцепочечных триацилглицеридов. Липазы можно получать из различных микробиологических, растительных и животных источников. В 2018 году рыночная стоимость микробных липаз составляла 425,0 млн долларов США, и ожидается, что к 2023 году она достигнет 590,2 млн долларов США, увеличившись в среднем на 6,8% в год (Chandra et al., 2020). Благодаря широкому спектру каталитической активности и более высокому выходу продукции микробные липазы считаются более полезными, чем липазы, получаемые из растений или животных. Кроме того, микробные липазы легко поддаются генетической модификации, на них не влияют сезонные изменения, они стабильны, безопасны в использовании и могут быть получены из микроорганизмов, которые быстро растут на дешёвых питательных средах (Reetz, 2013; Mendes 2012). Бактерии, грибы и дрожжи являются производителями липаз, на долю которых приходится около 90% мирового рынка липаз (Guerrand, 2017).

Липазы часто используются в производстве фруктовых соков, выпечки, пива и молочных продуктов (Raveendran и др., 2018). Коммерческие липазы в основном используются при обработке продуктов, содержащих жир, и для придания аромата молочным продуктам. Компании, производящие вино и напитки, используют липазу для усиления аромата продукции (Okpara, 2022). Липазы также используются в сливочном масле и маргарине для улучшения вкуса и увеличения срока хранения многих хлебобулочных изделий (Aravindan et al., 2007). Рекомбинантная липаза Fusarium oxysporumвырабатываемая в Aspergillus oryzaeзначительно увеличивает объем буханки и хлеба во время приготовления. (Melis et al., 2017a, 2017b). Novoren (Novo Nordisk) — это рекомбинантная аспарагиновая протеаза из Rhizomucor miehei, которая была получена в A. oryzae (Trono, 2019). Рекомбинантные Saccharomyces cerevisiae с липазой A из Bacillus subtilis были добавлены для улучшения разрыхления хлеба и общего аромата (Paciello и др., 2015). Когда экзогенная липаза из При добавлении Rhizopus oryzae (Belpan LIPO B) в муку было замечено, что качество хлеба улучшилось за счет увеличения объема буханки, повышения стабильности и улучшения качества мякиша, а также сохранения свежести (Sîrbu & Paslaru, 2005). Когда Мелис и др. (2017a, 2017b) исследовали влияние рекомбинантной липазы Fusarium oxysporum, экспрессируемой в Aspergillus oryzae, на производство хлеба, они обнаружили значительное увеличение объёма буханки и хлеба в целом.

Лакказа

Самая большая подгруппа мультимедных ферментов представлена лакказными ферментами, которые являются окислителями. Лакказные ферменты окисляют несколько соединений, в том числе фенолы, ароматические амины и аскорбат. Лакказные ферменты широко используются в пищевой промышленности, в том числе для желирования пектина сахарной свеклы, стабилизации вина и пива, а также для производства напитков (Mayolo-Deloisa и др., 2020). Эти ферменты обладают широким спектром субстратов, и их разнообразие зависит от конкретных источников микроорганизмов (Madhavi & Lele, 2009). Некоторыегрибы выделяют лакказы в качестве вторичных метаболитов в процессе ферментации (Morozova et al., 2007). Некоторые из распространённых грибов-продуцентов лакказ — это дейтеромицеты, аскомицеты и базидиомицеты (Гочев и Крастанов, 2007; Садхасивам и др., 2008). В результате абсорбционной ферментации гриб белой гнили Funalia trogii вырабатывает лакказу. F. trogii может вырабатывать 11 900 ед/л (Li и др., 2017). Рекомбинантные лакказы — ещё один продукт Bacillus licheniformis, который используется в промышленности (Тонин и др., 2016). В последнее время технология рекомбинантной ДНК используется для получения гетерологичного белка лакказы. Например, B.Гены vallismortis fmb-103 были клонированы и гетерологично экспрессированы в клетках E. coli BL21 (DE3) для производства этого фермента (Sun et al., 2017).

Лакказы используются для устранения помутнения, которое является распространенной проблемой в пивоваренной промышленности. Flavourstar, коммерческая лакказа производства Novozymes, используется в пивоваренной промышленности для устранения посторонних привкусов (Raveendran и др., 2018).

Среди множества ферментов, используемых в пищевой промышленности, аспарагиназы представляют собой обширный класс промышленных, нутрицевтических и фармацевтических ферментов (Кришнапура и др., 2016). Аспарагиназа, также известная как фермент, расщепляющий аспарагин, — это фермент, который катализирует расщепление аспарагина на последующие производные кислоты, аспарагиновую кислоту и аммиак (Равиндран и др., 2018). Аспарагин является незаменимой аминокислотой для человека, но он крайне важен для роста раковых клеток. В результате дефицит аспарагина значительно влияет на развитие раковых клеток, поэтому этот фермент действует как мощное противораковое средство (Кришнапура и др., 2016).

В пищевой промышленности аспарагиназа широко используется для борьбы с акриламидом — веществом, которое может вызывать рак у людей при приготовлении продуктов с высоким содержанием углеводов при высоких температурах. Аспарагин превращается в акриламид при многих способах обработки продуктов, включая выпекание и жарку в масле. Одним из таких примеров является высокотемпературная обработка картофеля при приготовлении картофельных чипсов (Адебо и др., 2017). Эта реакция характерна для всех продуктов с высоким содержанием углеводов, приготовленных при высоких температурах, и не ограничивается только картофельными чипсами (Мунир и др., 2020). Для миллионов людей, которые ежедневно употребляют эти продукты, существует значительный риск и серьёзные опасения по поводу воздействия акриламида (Адебо и др., 2017). Как упоминалось ранее, реакция Майяра в основном происходит при повышенных температурах и включает взаимодействие аспарагина и карбонильных соединений, содержащихся в продуктах с высоким содержанием углеводов, что приводит к образованию акриламида (Krishnakumar & Visvanathan, 2014). Аспарагиназа эффективно снижает уровень акриламида в картофеле и различных хлебобулочных изделиях, расщепляя аспарагин на аммиак и аспарагиновую кислоту (Borda & Alexe, 2011). Аспарагиназы , полученные из Aspergillus oryzae культуры Aspergillus niger, соответственно, широко продаются под названиями Acrylaway® (Novozymes, Дания) и PreventASeTM (DSM Food Specialties, Дания) (Adebo et al., 2017). По данным Управления по контролю за продуктами питания и лекарствами США (FDA), некоторые микробные источники, включая B. subtilis, вырабатывают ферменты, которые считаются приемлемыми для приготовления пищи. Рекомбинантные ферменты из микробных источников, такие как B. subtilis, были рекомендованы FDA как безопасные для использования в приготовлении пищи (Baskar & Renganathan, 2019). В результате аспарагиназа считается хорошим вспомогательным средством для предотвращения образования акриламида в пищевых продуктах. Следует подчеркнуть, что чрезвычайно термостабильная форма L-аспарагиназы необходима в пищевой промышленности, поскольку при выпечке и жарке используются высокие температуры (Zhang et al., 2019). L-аспарагиназа подвергается инкубации и предварительной обработке при высоких температурах, поэтому её стабильность и возможность повторного использования имеют решающее значение с коммерческой точки зрения. Из-за низкой стабильности и невозможности повторного использования цена на свободную L-аспарагиназу повышает стоимость производства продуктов питания и, следовательно, ограничивает её широкое применение. Однако L-аспарагиназу иммобилизировали с помощью различных веществ для повышения её ферментативной стабильности и возможности повторного использования, в том числе хитозана, сфер из агарозы, магнитных наночастиц и гранул из оксида алюминия, что может повысить доступность и снизить затраты на обработку продуктов питания (Цзя и др., 2021).

Лактаза - это гидролаза, которая способствует расщеплению лактозы с образованием более простых мономерных сахаров, таких как глюкоза и галактоза (Okpara, 2022). Большое разнообразие ресурсов, таких как животные, грибы и растения, и простота их доступности являются одним из основных преимуществ получения лактазы, также называемой β-галактозидазой (Panesar et al., 2010). Микроорганизмы предпочтительны для производства β-галактозидазы из-за их экономичности и более высокого выхода (Сантос и др., 1998; Задов, 2012). Лактазу обычно получают из грибка Aspergillus и дрожжей Kluyveromyces (Уилкинсон и др., 2003). В промышленности широко используются два основных класса лактаз. Они термостабильны и активны при низких температурах (Воловска и др., 2004). Лактаза производится исключительно в промышленных масштабах с использованием сертифицированных GRAS микроорганизмов для применения в молоке и молочных продуктах. Ферментная инженерия позволяет преобразовывать β-галактозидазу в гликозидазы. Например, для преобразования β-галактозидазы в β-глюкуронидазу, которая обладает более высокой субстратной специфичностью в отношении п-4-нитрофенил β-D-глюкуронида, чем фермент дикого типа (Lu et al., 2020), использовалась перетасовка ДНК. Мутанты β-галактозидазы из Bacillus circulans ATCC 31382 (BgaD), R484S и R484H, полученные с помощью сайт-направленного мутагенеза, изменили специфичность продукта и катализировали синтез новых GOS (Yin et al., 2017). С помощью сайт-направленного мутагенеза этого фермента были получены тройные мутанты (K166P, G307P и A833P), которые обладали более высокой термостабильностью при температуре 60 °C (Ишикава и др., 2015). Рациональная мутация была использована для увеличения периода полураспада, а также повышения каталитической эффективности Kluyveromyces lactis за счет добавления остатков цистеина на границах субъединиц (Рико-Диас и др., 2017). β-галактозидазы обычно ингибируются своим продуктом — галактозой, образующейся при гидролизе лактозы. Это ингибирование продуктом было преодолено с помощью рационального проектирования. Zhang et al. (2018) модифицировали связывающий галактозу мотив Asp258-Ser-Tyr-Pro-Leu-Gly-Phe264 Aspergillus niger β-галактозидазы до Asp258-Phe-Tyr-Thr-Ser-Ser-Phe264, чтобы уменьшить связывание фермента с галактозой.

Ожидается, что глобальная потребность в продуктах, связанных с питанием, будет расти и дальше по мере увеличения численности населения Земли. Как следствие, ожидается, что спрос на ферменты, используемые в пищевой промышленности, и размер мирового рынка пищевых ферментов будут продолжать расти. Чтобы удовлетворить потребность в промышленных ферментах, необходимо разработать новые ферменты с более высокой эффективностью и широким спектром применения в пищевой промышленности.

С помощью современных биотехнологических методов можно генетически модифицировать микробы, чтобы получать большое количество ферментов с заданными молекулярными характеристиками и более высокой ферментативной активностью. Также можно стимулировать развитие химерных ферментов с несколькими каталитическими активностями, генетически комбинируя гены каждого фермента из различных микроорганизмов. Благодаря сверхэкспрессии своих генов микробы могут производить ферменты с высокой специфической активностью в избыточных количествах, которые удовлетворяют коммерческие потребности. Существует множество потенциальных способов применения ферментов, полученных из микроорганизмов, и есть возможность расширить спектр коммерческого использования этих биологических катализаторов, особенно в пищевой промышленности.

Микробные ферменты обладают рядом преимуществ перед традиционными катализаторами в пищевой промышленности с точки зрения специфичности, а также безопасности для использования в продуктах питания. Различные микроорганизмы используются для получения важных для промышленности ферментов из-за их доступности и экономичного массового производства. Однако эти природные катализаторы имеют ограничения, в том числе в плане адаптации к условиям промышленной обработки, таким как высокая температура и pH, а также в отношении количества, необходимого для промышленного применения. Поэтому необходимо улучшить основные свойства этих ферментов для их использования в промышленности. Методы ферментной инженерии являются высокоэффективными методами улучшения свойств фермента для коммерческого применения. Эти методы не только помогают разработать ферменты с желаемыми свойствами, но и способствуют лучшему пониманию структуры промышленно важных ферментов, мест связывания их субстрата, а также их каталитических механизмов. Таким образом, разработка ферментов открыла возможности для ремоделирования и прогнозирования последовательностей с новыми функциями и свойствами. Несмотря на некоторые достижения в области инженерии ферментов, существует множество проблем, связанных с повышением эффективности этих биокатализаторов. Не хватает методов скрининга генетических вариантов, полученных в результате случайного мутагенеза. Дальнейшее развитие методов высокопроизводительного скрининга и инструментов генной инженерии поможет в создании улучшенных ферментов. Для расширения баз данных ферментов, содержащих структурную и функциональную информацию в области пищевой промышленности, необходимы обновлённые алгоритмы. Для улучшения этих баз данных могут быть полезны передовые инструменты биоинформатики. Кроме того, модуляция генов на основе CRISPR может значительно улучшить каталитические, субстрат-связывающие и стабилизирующие свойства ферментов. Такие передовые методы могут быть использованы для повышения эффективности микроорганизмов на генном уровне и могут быть полезны для удовлетворения потребностей потребителей на коммерческом и промышленном уровнях. Таким образом, в будущем сочетание передовых экспериментальных и вычислительных инструментов приведёт к усовершенствованию существующих или разработке новых ферментов с широкой субстратной специфичностью, термостабильными структурами и многофункциональными свойствами для пищевой промышленности.