Лабораторная работа №9. Занятие 4-х часовое. Микробиологическое исследование кормов.
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КОРМОВ
Цель занятия. Ознакомиться с методами санитарно-микробиологического анализа кормов.
Задание: Составьте классификацию кормов, сделайте конспект. Составьте схему комплексного микробиологического анализа кормов.
Классификация кормов- это их группировка по происхождению и ряду определяющих признаков (концентрация, доступность и соотношение питательных веществ, физическое состояние и др.). Такая группировка необходима для решения организационных вопросов, планирования кормовой базы, использования кормов. Особое значение классификация кормов и их кодирование приобретают при использовании математических методов и ЭВМ в вопросах плакирования кормовой базы и организации кормления сельскохозяйственных животных. Классификация кормов в нашей стране впервые была определена государственным стандартом в 1934 г., который действует и в настоящее время. С появлением новых технологий заготовки кормов их классификация, регламентированная этим стандартом, не отвечает современным требованиям. Поэтому возникла необходимость разработки классификации, полностью охватывающей все существующие кормовые средства. По происхождению все корма подразделяют на: 1) корма растительного происхождения; 2) корма животного происхождения; 3) комбикорма; 4) синтетические препараты; 5) пищевые отходы; 6) минеральные корма; 7) биологически активные добавки. Корма растительного происхождения.По определяющим признакам их разделяют на объемистые и концентрированные. Объемистые корма.Они приготовлены из вегетативной массы растений, корнеклубнеплодов, сочных плодов и побочных продуктов пищевых производств, бывают сухими и влажными. В группу сухих входят корма, в которых содержится не более 22% влаги и 0,65 корм.ед. (до 7,3 МДж обменной энергии) в 1 кг сухого вещества. Грубые корма–это сено, солома, мякина.
Влажные объемистые корма содержат более 40% воды. Их подразделяют на сочные и водянистые. Для сочных кормов характерно то, что основная масса воды находится в связанном состоянии и входит в состав протоплазмы или растительного сока. Это зеленые корма, силос, сенаж, корнеклубнеплоды, бахчевые культуры, различные овощи. К водянистым кормам относятся остатки промышленной переработки сельскохозяйственного сырья, в которых вода содержится в свободном состоянии и является примесью. Это свежий и кислый жом, барда, мезга, плодовые выжимки, пивная дробина. Концентрированные корма - это зерно и семена фуражных и продовольственных культур, продукты переработки зерновых и масличных культур, травяная мука из бобовых. В этих кормах содержится не менее 0,7 корм.ед., не более 19% клетчатки и менее 40% воды. Корма животного происхождения.Их получают при переработке животноводческой продукции и рыбы. В них содержится высокоценный по аминокислотному составу белок. Сюда относятся мука животного происхождения, рыбная мука, перьевая мука, гидролизаткератинового сырья, крилевая мука, вторичное молочное сырье и сухие продукты из него. Комбикорма.Это однородные смеси кормовых средств, составленные по научно-обоснованным рецептам, предназначенные для определенного вида и производственной группы животных и обеспечивающие наиболее полное и эффективное использование содержащихся в них питательных веществ. Различают полнорационные комбикорма, комбикорма-концентраты, белкововитаминно-минеральные добавки (БВМД), премиксы и комбикорма специального назначения. Синтетические препараты. Продукты химического и микробиологического синтеза. Характеризуются высокой концентрацией питательных веществ. К этой группе относятся синтетические азотсодержащие вещества (мочевина и фосфаты аммония, аммиачная вода), кормовые дрожжи, кормовой концентрат L-лизина, DL-метионин. Пищевые отходы.Это остатки овощей и фруктов, очистки картофеля, а также неиспользованная пища и другие продукты, приготовленные в домашних условиях, системе общепита, а также консервной промышленности. Минеральные корма.Дополнительные источники минеральных веществ, вырабатываемые из природного сырья. Сюда относятся фосфаты кальция и натрия, поваренная соль, мел, различные глины, специально приготовленные многокомпонентные брикеты и блоки-лизунцы. Биологически активные добавки.Это естественные и синтетические продукты высокой биологической активности, используемые в очень малых дозах. К ним относятся соли микроэлементов, витаминные, ферментные и гормональные препараты, антибиотики, транквилизаторы.
Отбор проб
Сначала осматривают всю партию кормов и знакомятся с условиями их хранения, затем отбирают отдельные пробы, составляя исходные и средние образцы.
Пробы берут из разных мест партии кормов (по поверхности и по глубине), и если они однородны, то их смешивают и составляют среднюю пробу не менее 1-2 кг. Если в отдельных местах (участках, гнездах) обнаруживают изменение качества и внешнего вида кормов, то пробы из таких мест отбирают отдельно.
Посуда (тара) для упаковки кормов должна быть чистая и не влиять на их качество. Для микробиологических и микологических исследований образцы кормов отбирают в стерильную посуду.
Для определения микробной обсемененности берут пробу корма. В стерильную пробирку помещают 1 г корма, взятого из средней пробы, добавляют 9 мл физиологического раствора и тщательно встряхивают (получают разведение 1 : 10). Из взвеси готовят последующие разведения (1 : 100, 1: 1000, 1 : 10 000 и т. д.). После осаждения взвешенных частиц для посевов берут жидкость из верхнего слоя.Для количественного учета микробов в стерильные чашки Петри вносят по 1 мл из пробирок с разным разведением и доливают 10— 15 мл стерильного, расплавленного и охлажденного до температуры 44—45 °С мясо-пептонного агара (МПА). Осторожно покачивая чашки, засеянный материал равномерно распределяют в агаре. После застывания среды чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре 37 "С на 24—48 ч. После этого подсчитывают выросшие колонии. Полученные результаты умножают на степень разведения, суммируют и определяют количество микробов в 1 г корма.
Пример расчета. В первой чашке обнаружено 200 колоний, во второй — 21, в третьей — 1. В эти чашки посевной материал брали из пробирок с разведениями соответственно 1: 10 000,1 :100 000,1 :1000 000. Следовательно, в 1 г корма будет содержаться
Микробную обремененность мясо-костной муки можно определить экспресс-методом с применением резазурина. Для этого в одну стерильную пробирку помещают 1 г средней пробы мясо-костной муки, добавляют 10 мл мясо-пептонного бульона (МПБ) и встряхивают, а в другую пробирку (для контроля) вносят только 10 мл МПБ. Пробирки помещают в термостат при 40 "С на 3 ч. После этого в них добавляют по 1 мл 0,01%-ного раствора резазурина и вновь выдерживают в термостате в течение 2 ч.
Результаты реакций учитывают через каждые 30 мин. По восстановлению резазурина (изменению окраски из синей в розовую) определяют общую микробную обсемененность мясо-костной муки. Если в пробирке с мясо-костной мукой розовое окрашивание наступает позднее чем через 2 ч, то это говорит о том, что в 1 г продукта содержится до 500 тыс. микробов, а при окрашивании в розовый цвет до 2ч — более 500 тыс. микробов.
Контролем служит пробирка с 10 мл МПБ и 1 мл 0,01 %-ного раствора резазурина, выдержанная в термостате при том же температурном режиме и экспозиции и без изменения цвета содержимого.
Исследование на сальмонеллы. Для анализа берут 50— 200 г исследуемого корма, измельчают его в стерильной фарфоровой ступке и переносят в колбу со средой предварительного обогащения (пептонная вода, МПБ с содержанием 5 % маннита) при соотношении материала и среды 1:5. Содержимое колбы тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 37 °С. Через 16—18 ч материал высевают в чашки Петри на твердые дифференциально-диагностические среды (висмут-сульфит-агар, среда Плоскирева или Левина) и на две основные среды обогащения (селенитовый бульон, среда Киллиана в соотношении 1:1).
После 16—18 ч выдержки в термостате при 37 °С из сред обогащения делают вторично посевы в чашки с висмут-сульфит-агаром и в чашки со средами Плоскирева и Левина (по выбору) и ставят их в термостат при 37 °С.
Чашки просматривают через 16—24 и 48 ч.
На висмут-сульфит-агаре S. typhi и S.paratyphi А растут в виде мелких, нежных, серовато-зеленых колоний с черным центром, S. cholerae suis — в виде зеленых колоний. Колонии всех других сальмонелл значительно крупнее, темно-коричневого цвета, с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом, участок среды под колонией черный. На среде Плоскирева вырастают прозрачные или нежно-розовые колонии, на среде Левина — прозрачные, бледные, нежно-розовые или розовато-фиолетовые.
В случае обнаружения колоний, похожих на сальмонеллы, 3—5 из них высевают на комбинированную среду Ресселя или скошенный агар с мочевиной и бульон Хотгингера для определения индола и сероводорода (под пробирки с бульоном подкладывают специальные индикаторные бумажки). Для определения подвижности культуры делают посев уколом в полужидкий агар (0,3—0,5%-ный).
На среду Ресселя и скошенный агар посевы делают сначала штрихом на скошенной поверхности, а затем уколом в глубину столбика. Если разлагается мочевина в скошенном агаре, то окраска среды меняется на оранжевую при индикаторе BP и на коричнево-фиолетовую при индикаторе тимоловый синий в сочетании с индикато-ром Андраде.
Морфологию культуры изучают в мазках, окрашенных по Граму, и подвижность — в висячей или раздавленной капле или полужидком агаре. Культуры, представляющие грамотрицательные подвижные палочки, ферментирующие глюкозу с образованием газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие мочевину и не образующие индол, исследуют серологически — испытывают в реакции агглютинации (РА) на предметном стекле с набором агглютинирующей адсорбированной поливалентной сальмонеллезной О-сыворотки (группы, А, В, С, D, Е).
Для РА с О-сыворотками культуру следует брать из верхней части скошенного агара, а для агглютинации с Н-сыворотками — из нижней части (конденсационной воды), где микробы наиболее подвижны. По групповой О-сыворотке устанавливают принадлежность культур к той или иной серологической группе.
Исследования на энтеропатогенные типы кишечной палочки. 50 г корма помещают в колбу, содержащую 500 мл стерильного физиологического раствора, встряхивают на шуггель-аппарате в течение 20 мин. Из полученной взвеси стерильными пипетками готовят разведения 1 : 100, 1 : 1000, 1 : 10 000, 1 : 100 000, 1 : 1 000 000. По 1 мл каждого разведения вносят в пробирки со средой Эйкмана. Посевы помешают в термостат при температуре 43 °С. Через 24 ч учитывают рост по помутнению среды и образованию газа. Титр кишечной палочки устанавливают по наи-большему разведению, в котором еще наблюдался ее рост.
Из пробирок, где наблюдается рост микробов, производят посев на плотные дифференциальные среды (Эндо, Левина, Плоскирева), разделенные на секторы для каждого разведения.
Типичные колонии Е. coli круглой формы, гладкие, выпуклые или слегка приподнятые в центре с ровными краями розового, красного или малинового цвета, с металлическим блеском или без него на среде Эндо или черного цвета на среде Левина.
Выросшие изолированные колонии S-формы (не менее 4) пересевают на МПБ, выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 16—24 ч. После этого одну часть пробирок используют для приготовления мазков, посевов на дифференциальные диагностические среды, заражения мышей; вторую — для приготовления автоклавированного антигена, если кипяченый антиген не будет агглютинироваться поливалентными (комплексными) коли-сыворотками.
У выделенных культур определяют морфологические и культурально-биохимические свойства для установления их родовой принадлежности. Морфологию бактерий изучают в мазках, окрашенных по Граму, их подвижность определяют по характеру роста в 0,3%-ном полужидком МПА.
Для определения культурально-биохимических свойств бактерий используют набор питательных сред (с углеводами и индикатором Андраде, цитратно-аммонийную, мясо-пептонный желатин, МПБ или бульон Хоттингера и агар с глюкозой и сернокислым железом).
Патогенные свойства кишечной палочки определяют путем постановки биологической пробы на белых мышах. Для этого трем мышам массой 14—16 г внутрибрюшинно вводят смывы с суточных агаровых культур в дозе 500 млн микробов. Культуру признают патогенной в случае гибели одной или более мышей в первые 4 сут после заражения.
Исследования на анаэробы. 50 г корма растирают в стерильной ступке, разводят физиологическим раствором и засевают в несколько пробирок со средой Китга—Тароцци, Вильсона—Блера, молоком и в две чашки со средами и кровяным агаром по Цейслеру. Для уничтожения вегетативных форм микробов по одной пробирке с жидкими средами нагревают при температуре 80 °С в течение 20 мин. Посевы помещают в термостат при температуре 37 °С. Чашки должны находиться в специальных аппаратах для анаэробных культур или в эксикаторе, куда заранее вносят тот или иной погло-титель кислорода.
Результаты посевов регистрируют в тот же день. Почернение среды Вильсона—Блера в течение 1 —3 ч после посева, свертывание молока с образованием ноздревато-губчатого сгустка и прозрачной сыворотки в течение 6 ч, а также быстрое начало роста на среде Китта—Тароцци (через 4—5 ч) при обильном газообразовании — характерные признаки присутствия возбудителей Cl. perfringens.
Рост CI. botulinum, наблюдаемый обычно на 2—3 сут, характеризуется помутнением среды Китта—Тароцци, образованием осадка и появлением запаха прогорклого масла.
При обнаружении роста на среде Китта—Тароцци проводят микроскопическое исследование и выделение чистой культуры посевом в 2—3 чашки с кровяным агаром по Цейслеру. Последние выдерживают в анаэробных условиях при температуре 37 °С в течение 24— 48 ч, после чего просматривают рост в чашках и отбирают культуры, которые классифицируют по морфологическим и биохимическим свойствам.