Лабораторная работа №8. Микробиологическое исследование воды.

В зависимости от водоисточника воду питьевую подразделяют на:

- артезианскую, родниковую (ключевую), грунтовую (инфильтрационную) - из подземного водоисточника;

- речную, озерную, ледниковую - из поверхностного водоисточника.

В РФ качество питьевой воды в настоящее время регламентируется СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. Гигиенические требования к обеспечению безопасности систем горячего водоснабжения» (с изменениями на 2 апреля 2018 года).

Государственный санитарно-эпидемиологический надзор за качеством питьевой воды осуществляют органы и учреждения государственной санитарно-эпидемиологической службы в соответствии с нормативными и методическими документами Госсанэпидслужбы России в плановом порядке и по санитарно-эпидемиологическим показаниям.

Количество и периодичность микробиологических проб воды в местах водозабора, отбираемых для лабораторных исследований составляет не менее 4 в год (по сезонам года) для подземных источников и не менее 12 (ежемесячно) – для поверхностных источников.

Отбор проб в распределительной сети проводят из уличных водоразборных устройств на наиболее возвышенных и тупиковых ее участках, а также из кранов внутренних водопроводных сетей всех домов, имеющих подкачку и местные водонапорные баки.

Безопасность питьевой воды в эпидемическом отношении, в соответствии требованиям СанПиН 2.1.4.1074-01, представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Безопасность питьевой воды в эпидемическом отношении

Отбор микробиологических проб для  поверхностных, подземных, питьевых, сточных вод, а также воды плавательных бассейнов осуществляется в соответствии с ГОСТ 31942-2012 (ISO 19458:2006) «Вода. Отбор проб для микробиологического анализа».

Для отбора проб питьевой воды применяют чистые стерильные емкости, изготовленные из стекла или полимерных материалов (например, полипропилена, полистирола, полиэтилена, поликарбоната), не оказывающих влияние на жизнедеятельность микроорганизмов. Для отбора проб погружением в чистую воду используют емкости, которые должны быть стерильными как внутри, так и снаружи, и защищены от загрязнений при хранении после стерилизации.

В большинстве случаев вместимость емкости для отбора проб должна быть не менее 500 см³, что, как правило, достаточно для определения 4-5 индикаторных микроорганизмов.

Стерильную емкость для отбора проб открывают непосредственно перед отбором пробы, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Пробка и края емкости не должны касаться посторонних поверхностей.

После наполнения емкость немедленно закрывают стерильной пробкой и стерильным колпачком. При заполнении емкости должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью налитой воды.

При отборе проб воды из крана (в точке потребления) не допускается удаление приспособлений и вкладышей не проводится, не осуществляют дезинфекцию крана и спуск воды обильным потоком.

До отбора проб или сразу же после отбора следует нанести маркировку на емкость и заполнить акт отбора пробы.

Для транспортирования предпочтительно охладить пробы до температуры (5±3) °С. Пробы воды для вирусологического исследования допускается замораживать и хранить при температуре минус 70 °С при добавлении к пробе соответствующего криопротектора.

Время хранения проб воды от отбора до начала их анализа включает продолжительность транспортирования, регистрации и подготовки проб к анализу.

Время хранения должно быть минимальным, насколько возможно, и задокументировано. Анализ проб воды должен быть начат в тот же рабочий день, в который осуществлен отбор проб. В таблице 2 представлены максимальный срок хранения пробы воды, включая продолжительность транспортирования, а также значения температуры хранения пробы для некоторых микроорганизмов.

 Таблица 2 - Максимальный срок хранения пробы воды, включая продолжительность транспортирования, а также значения температуры хранения пробы для некоторых микроорганизмов

Исследования воды на наличие патогенных микроорганизмов могут проводиться только в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о соответствии условий выполнения работ санитарным правилам и лицензию на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний.

Цель работы: ознакомиться с качественными и количественными методами санитарно-бактериологического исследования воды питьевого назначения.  

Оборудование и инструменты: стерильная колба объемом 500 см³, образец питьевой воды для исследования, пробирки со стерильной агаризованной средой № 1 или МПА для культивирования микроорганизмов, пробирки со стерильным 0,9 % раствором NaCl для приготовления разведений, стерильные чашки Петри, стерильные пипетки, система фильтрации открытого типа, бактериальные фильтры, стерильные пинцеты, стерильные чашки Петри со стерильной агаризованной средой Эндо, колбы и пробирки со стерильной средой Кесслера.

Определение общего микробного числа (ОМЧ) методом заливки питательным агаром. Водопроводную воду и воду артезианских колодцев засевают в неразведенном виде по 1 см³. При анализе проб воды нецентрализованного водоснабжения, поверхностного водоема или воды неизвестного уровня микробного загрязнения из каждой пробы делают посев по 1 см³ воды без разведения и по 1 см³ из 1-го и 2-го десятикратных разведений (но не менее двух объемов с разным содержанием исходной анализируемой воды), выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках Петри выросло от 20 до 300 колоний.

Посев воды проводят после тщательного перемешивания пробы. При посеве, соблюдая правила стерильности, вносят по 1 см³ воды из пробы или соответствующих разведений в стерильные чашки Петри и заливают 10-12 см³ растопленной и осту­женной до 45-48 °С среды № 1 (МПА), предварительно фламбируя край пробирки. Вращая чашку Петри по горизонтальной поверхности стола круговыми движе­ниями, распределяют содержимое равномерным слоем по всей площади дна. После застывания агаризованной среды чашки Петри с посевами помещают вверх дном в термостат и инкубируют при температуре (36±2) °С в течение (24±4) ч. Если рост колоний на чашках с посевами через 24 ч не обнаружен, то продолжают инкубацию посевов до 48 ч.

После инкубации посевов чашки с посевами извлекают из термостата, подсчитывают число всех выросших на чашках колоний микроорганизмов (N). Подсчет проводят только на тех чашках, на которых выросло от 20 до 300 колоний.

Число колоний микроорганизмов (X, КОЕ/см³) анализируемой пробы воды рассчитывают по формуле:

X=N/V,

где N - суммарное число колоний, подсчитанных на чашках; V - общий объем исходной анализируемой воды, использованный для посева на чашки Петри, на которых велся учет, в том числе включающий объемы исходной анализируемой воды, использованной при разведении, см³.

Определение количества БГКП методом мембранных фильтров (ГОСТ 31955.1-2013 – «Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Escherichia coli и колиморфных бактерий»). Фильтруют 100 см³ или больший объем исследуемой пробы (например, 300 см³ - для воды, расфасованной в емкости), используя мембранный фильтр,  удерживающий микроорганизмы и оборудование для мембранной фильтрации.

При испытаниях по стандартному тесту мембрану помещают на селективную агаризованную культуральную среду Эндо в чашку Петри, обеспечивая отсутствие пузырьков воздуха под мембранным фильтром и проводят инкубацию отфильтрованных микроорганизмов при (36±2) °С в течение (21±3) ч. Если после инкубации посева микроорганизмов в течение (21±3) ч не обнаружены типичные колонии микроорганизмов, то увеличивают продолжительность инкубации до (44±4) ч.

После окончания инкубации учитывают колонии с темно-красной окраской с металлическим блеском или без него, слизистые с красным центром и отпечатком на оборотной стороне фильтра.

Результат выражают в виде коли-индекса, определяемого посредством суммиро­вания колоний кишечных палочек, выросших на поверхности мембранных фильтров в одной пробе воды, и пересчитывают это количество на 1 л воды (например, коли-индекс = (1000*15)/300).

Коли-титр = 1000/коли-индекс.

Согласно требованиям ГОСТ на питьевую воду коли-индекс должен быть не более 3, коли-титр – не менее 333.

Определение количества БГКП бродильным (титрационным) методом с помощью определения наиболее вероятного числа (НВЧ). Сущность метода заключается в посеве определенных объемов анализируемой воды и подращивании при (37±0,5) °С в средах накопления с последующим высевом бактерий на плотную среду Эндо.

При исследовании на этапах очистки и обеззараживания засевают 100,0; 10,0; 1,0 и 0,1 см³ воды; на выходе в водопроводную сеть и в наиболее характерных ее точках засевают три объема по 100,0 см³, три объема по 10,0 см³ и три объема по 1,0 см³.

Посев 100,0 и 10,0 см³ воды проводят в стерильные колбы и пробирки соответственно с 10,0 и 1,0 см³ концентрированной среды Кесслера; посев 1,0 и 0,1 см³ воды - в пробирки с 10,0 см³ среды нормальной концентрации. Посевы инкубируют 24 ч при (37±0,5) °С. Отсутствие помутнения и образования кислоты и газа в пробирках позволяет получить отрицательный результат.

Из каждой пробирки, где отмечены помутнение, кислота и газ, высевают петлей штрихами на поверхность среды Эндо, разделенной на 3-4 сектора. Чашки помещают крышками вниз в термостат и инкубируют 16-18 ч при (37±0,5) °С.

Если при высеве из пробирок, где отмечены помутнение, кислота и газ, на секторах среды Эндо выросли темно-красные с металлическим блеском и без него (лактозоположительные) колонии, то их принадлежность к бактериям группы кишечных палочек подтверждают микроскопированием.

При анализе питьевой воды учитывают и те сектора, где выросли только розовые и бесцветные колонии. Из двух-трех разного типа колоний каждого сектора приготовляют мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.

Результат анализа выражают в виде колииндекса (наиболее вероятное число бактерий группы кишечных палочек в 1 дм³ воды), значение которого определяют по таблице 3.

 Таблица 3 - Определение индекса бактерий группы кишечных палочек при исследовании 300 см³ воды

Задание - опишите следующие процедуры:

1. Как определить ОМЧ воды питьевого назначения методом заливки питательным агаром, произвести расчет, проверить на соответствие нормативным показателям;
2. Как определить количество БГКП в воде питьевого назначения бродильным (титрационным) методом, рассчитать коли-индекс и коли-титр, проверить на соответствие нормативным показателям;
3. Как оценить культуральные и морфологические признаки микроорганизмов (приготовление фиксированных мазков, окрашивание по Граму, микроскопирование).