_{Окрашивание по Граму — это экспрессный метод исследования, позволяющий установить наличие бактерий в образце и дифференцировать их как грамположительные либо грамотрицательные. Метод основан на химических и физических свойствах клеточной оболочки. Метод Грама почти всегда применяют в качестве первого шага при диагностике бактериальных инфекций.}

_{Метод был предложен датским ученым Г.К.Грамом, который разработал его в 1882 и опубликовал в 1884 году, как способ, позволяющий дифференцировать сходные по симптомам бактериальные инфекции: Streptococcus pneumoniae (пневмококк) и Klebsiella pneumoniae.[2]}

Часть 1

Подготовка образца

1. 
   1
   Приготовьтесь к работе. Наденьте перчатки и подвяжите длинные волосы, чтобы не загрязнить исследуемый образец. Выберите рабочее место под вытяжкой или в другом хорошо проветриваемом месте и продезинфицируйте его. Прежде чем приступить к работе, проверьте, исправны ли горелка Бунзена и оптический микроскоп.
2. 
   2
   Продезинфицируйте предметное стекло. Если предметное стекло недостаточно чистое, вымойте его водой с мылом, чтобы удалить жир и грязь. После этого продезинфицируйте его этанолом, очистителем для стекол или другим способом, который принят в вашей лаборатории.
3. 
   3
   Поместите образец на предметное стекло. Окрашивание по Граму позволяет увидеть отдельные бактерии в медицинских образцах или культуры бактерий в чашке Петри. Для начала нанесите на предметное стекло тонкий слой исследуемой жидкости. Рекомендуется не выдерживать образец дольше 24 часов, так как со временем у бактерий повреждаются клеточные стенки, и их реакция на окрашивание по Граму становится менее предсказуемой.^[3]

   • Если вы исследуете образец тканей, нанесите на предметное стекло 1–2 капли. Распределите жидкость тонким слоем по предметному стеклу с помощью края другого чистого стекла. Подождите, пока образец высохнет.
   • Если вы окрашиваете бактерии из чашки Петри, стерилизуйте бактериологическую петлю в пламени горелки Бунзена, пока она не начнет светиться, а затем дайте ей остыть. Нанесите петлей каплю стерилизованной воды на стекло, затем повторно стерилизуйте петлю, дайте ей остыть, аккуратно захватите крохотный образец культуры бактерий и растворите его в воде.
   • Бактерии в питательной среде сначала следует перемешать в вихревом смесителе, а затем петлей перенести образец на предметное стекло без добавления воды.
   • Если вы исследуете мазок, слегка прижмите его к предметному стеклу.
4. 
   4
   Зафиксируйте образец. Под действием тепла бактерии пристанут к стеклу, и их не смоет при окрашивании. Быстро проведите 2-3 раза предметным стеклом над верхней частью пламени горелки или нагрейте его на электрическом нагревателе. Не перегрейте предметное стекло, чтобы не внести изменения в образец. Если вы используете горелку Бунзена, следите, чтобы пламя было небольшим и имело вид голубого конуса, а не высокого оранжевого столба.^[7]

   • Можно зафиксировать препарат и метанолом. Нанесите на высушенный образец 1-2 капли метилового спирта, слейте излишки спирта и высушите предметное стекло на воздухе. Данный способ предпочтительнее в силу того, что он меньше повреждает исследуемые клетки и дает более чистый фон.
5. 
   5
   Поместите предметное стекло в лоток для окрашивания. Этот лоток представляет собой неглубокое металлическое, стеклянное или пластиковое блюдце с мелкой сеткой для поддержки образцов. Положите стекло с препаратом на сетку, так чтобы используемая при окраске жидкость стекала в лоток.

   • Если у вас нет лотка для окрашивания, предметное стекло можно положить поверх пластиковой формы для льда.^[8]

Часть2

Проведение окрашивания по Граму

1. 
   1
   Нанесите на образец раствор кристаллического фиолетового (кристаллвиолета). Наберите раствор кристаллического фиолетового (его иногда называют генциановым фиолетовым) в пипетку и нанесите несколько капель на препарат. Подождите 30-60 секунд. Кристаллический фиолетовый (КФ) диссоциирует в воде с образованием ионов КФ+ и хлора (Cl–). Эти ионы проникают через клеточную оболочку и мембрану как грамположительных, так и грамотрицательных клеток. Ионы КФ+ взаимодействуют с отрицательно заряженными компонентами бактериальных клеток и окрашивают их в фиолетовый цвет.

   • Во многих лабораториях используют "кристаллвиолет Хукера". В эту модификацию входит щавелевокислый аммоний, который предотвращает выпадение осадка.
2. 
   2
   Аккуратно смойте краситель водой. Наклоните предметное стекло и пустите на него слабую струю дистиллированной или водопроводной воды из промывной склянки. Направляйте струю в сторону от препарата, чтобы вода лишь слегка омывала его. Будьте осторожны, так как слишком сильный напор может смыть грамположительные бактерии.
3. 
   3
   Нанесите на образец йод, затем смойте его. С помощью пипетки покройте образец йодом. Оставьте йод хотя бы на 60 секунд, после чего аккуратно смойте его водой так же, как раньше смыли краситель.^[11] Йод в виде отрицательно заряженных ионов взаимодействует с ионами КФ+, в результате чего во внешних и внутренних слоях клеток формируются крупные комплексы кристаллвиолета и йода. Это фиксирует попавший в клетки кристаллвиолет.

   • Йод является едким веществом. Избегайте контакта йода с кожей, не глотайте его и не вдыхайте его пары.
4. 
   4
   Добавьте обесцвечивающее вещество и сразу же смойте его. Обычно используют смесь ацетона и этанола в пропорции 1:1, при этом следует аккуратно выдержать время. Расположите предметное стекло под углом и добавляйте на него обесцвечивающее средство до тех пор, пока стекающая жидкость не потеряет фиолетовый оттенок и станет прозрачной. Обычно это занимает не более 10 секунд, особенно если обесцвечивающий раствор содержит большое количество ацетона. Если вы вовремя не остановитесь, раствор может вымыть краситель как из грамположительных, так и грамотрицательных клеток, и вам придется повторить процедуру окрашивания. Немедленно смойте остатки обесцвечивающего раствора так же, как делали это ранее с красителем.

   • В качестве обесцвечивающего вещества можно также использовать чистый (95% и выше) ацетон.^[12] Чем больше в обесцвечивающем растворе ацетона, тем быстрее произойдет обесцвечивание, что потребует большей точности.
   • Если вам сложно угадать со временем, добавляйте обесцвечивающий раствор по одной капле.^[13]
5. 
   5
   Нанесите на образец контрастный краситель и смойте его водой. Контрастный краситель, в качестве которого используют обычно сафранин или фуксин, позволяет получить дополнительный контраст между грамположительными и грамотрицательными клетками за счет того, что окрашивает бесцветные (грамотрицательные) бактерии в розовый или красный цвет. Оставьте контрастный краситель на образце хотя бы на 45 секунд, после чего смойте его водой.^[16]

   • Фуксин придает многим грамотрицательным бактериям (к примеру, таким как haemophilus и legionella) более интенсивный цвет. 
6. 
   6
   Высушите предметное стекло. Можно просто оставить его на воздухе, либо промокнуть фильтровальной бумагой. После этого окрашивание по Граму завершено.

Часть 3

Проверка результатов

1. 
   1
   Подготовьте оптический микроскоп. Положите стекло с образцом на предметный столик. Бактерии значительно различаются по размерам, поэтому вам может понадобиться увеличение от 400x до 1000x.^[19] При тысячекратном увеличении для лучшего контраста рекомендуется использовать объектив с масляной иммерсией. Нанесите на предметное стекло каплю иммерсионного масла, и при этом старайтесь, чтобы стекло не двигалось, иначе в масле могут образоваться пузырьки. Затем с помощью турели микроскопа выставьте необходимый вам объектив так, чтобы он коснулся масла.

   • Метод масляной иммерсии применим лишь для специальных, а не "сухих" объективов.
2. 
   2
   Определите грамположительные и грамотрицательные бактерии. Рассмотрите предметное стекло под оптическим микроскопом. Грамположительные бактерии будут окрашены в фиолетовый цвет, поскольку внутри их толстых клеточных стенок оказался кристаллвиолет. Грамотрицательные бактерии должны быть розовыми или красными, так как кристаллвиолет был вымыт через их тонкие клеточные стенки, после чего в них проник розовый контрастный краситель.

   • Если образец слишком толст, это может привести к ошибочным положительным результатам. Если бактерии всех типов выглядят как грамположительные, окрасьте еще один образец, чтобы удостовериться в правильности результатов.
   • Если образец слишком долго находился под воздействием обесцвечивающего раствора, это может привести к ошибочным отрицательным результатам. Окрасьте еще один образец, чтобы убедиться в том, что все бактерии действительно грамотрицательные.
3. 
   3
   Сравните свои результаты с эталонными изображениями. Если вы не уверены в том, какие бактерии видите, то просмотрите набор эталонных изображений, которые отсортированы по форме бактерий и результатам окрашивания по Граму. Подобный набор можно найти в Интернете на National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos и многих других сайтах. Ниже приведены наиболее распространенные или важные для диагностики примеры, которые помогут вам идентифицировать бактерии.
4. 
   4
   Распознайте грамположительные бактерии по форме. Вид бактерий можно определить по их форме в микроскопе: часто это бывают кокки (округлые) и бациллы (палочковидные). Вот несколько распространенных форм грамположительных (фиолетовых) бактерий:

   • Грамположительные кокки — как правило это стафилококки (в виде виноградных гроздьев) или стрептококки (образуют цепочки).
   • Грамположительные палочки включают в себя бациллы, клостридии, коринебактерии и листерии. Представители рода актиномицеты часто имеют ответвления и нити.
5. 
   5
   Распознайте грамотрицательные бактерии. Часто грамотрицательные (розовые) бактерии разделяют на три группы: кокки (округлые), палочковидные (длинные и тонкие) и кокковидные, которые имеют промежуточную форму.

   • Грамотрицательные кокки чаще всего представлены различными видами Neisseria.
   • Грамотрицательные палочки включают в себя кишечную палочку, энтеробактерии, клебсиеллы, цитробактерии, серратии, протеи, сальмонеллы, шигеллы, псевдомонады и многие другие. Холерные вибрионы также могут иметь вид обычных или изогнутых палочек.^[22]
   • Грамотрицательные "кокковидные" палочки (или "коккобацилы") включают в себя бордетеллы, бруцеллы, гемофилы и пастереллы.
6. 
   
7. 
   6
   Оцените неоднозначные результаты. Некоторые бактерии не поддаются однозначному окрашиванию из-за того, что их клеточные стенки непрочны или покрыты жирами. Такие бактерии могут одновременно окрашиваться в фиолетовый и розовый цвет в пределах одной клетки, либо клетки одного и того же вида могут окрашиваться по-разному в одном мазке. Подобная проблема может наблюдаться на любом образце бактерий, который пролежал более 24 часов, однако некоторые виды бактерий подвержены этому независимо от свежести образца. В этом случае для точного определения бактерий могут понадобиться более специализированные методы, такие как окраска по Цилю-Нильсену, наблюдение за ростом культуры, тест TSI (тройной сахар железа), генетическое тестирование.^[23]

   • Актиномицеты, артробактерии, коринебактерии, микобактерии и пропионбактерии считаются грамположительными, однако часто их окрашивание по Граму приводит к неоднозначным результатам.^[24]
   • Мелкие и тонкие бактерии, такие как трепонемы, хламидии и риккетсии, плохо поддаются окрашиванию по Граму.^[25]
8. 
   7
   Выбросьте использованные материалы. Процедура утилизации отходов зависит от конкретной лаборатории и того, какие материалы использовались. Как правило, жидкость из лотка для окрашивания считается опасным материалом и переливается в плотно закрывающиеся бутылки. Использованные предметные стекла вымачиваются в 10%-ном растворе отбеливателя, после чего помещаются в контейнеры для сбора и утилизации игл и медицинских отходов.

Советы

• Помните о том, что результаты окрашивания по Граму во многом определяются тем, насколько хорош образец. Необходимо научить пациентов получать хорошие образцы для анализа (например, мокроту после глубокого кашля, а не простую слюну).
• При обесцвечивании этиловый спирт действует медленнее, чем ацетон.
• При работе в лаборатории соблюдайте стандартную технику безопасности.
• Для практики используйте ватную палочку, поскольку образец должен содержать как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии. Если наблюдается лишь один тип бактерий, то это, скорее всего, означает, что вы либо недостаточно, либо слишком сильно обработали образец обесцвечивающим раствором.
• Предметные стекла можно брать деревянной прищепкой.

Предупреждения

• Ацетон и спирт огнеопасны. При попадании на ладони ацетон обезжиривает кожу, в результате чего в нее легче впитываются другие вещества. Надевайте перчатки и соблюдайте другие меры предосторожности.
• Следите за тем, чтобы препарат не высох, прежде чем вы смоете основной или контрастный краситель.^[28]